《Journal of Agriculture and Food Research》：Integrated Metabolomic and Chemometric Profiling Reveals Quality-Related Chemical Changes in Musang King Durian during Long-Term Frozen Storage
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长期冷冻贮藏会改变猫山王榴莲（Musang King durian, MKD）的化学轮廓。非靶向气相色谱-高分辨质谱（GC-HRMS）鉴定出41种极性代谢物和53种挥发性化合物。碳水化合物和氨基酸代谢对冷冻贮藏产生响应。在12个月的贮藏期内，脂肪
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长期冷冻贮藏会改变猫山王榴莲（Musang King durian, MKD）的化学轮廓。非靶向气相色谱-高分辨质谱（GC-HRMS）鉴定出41种极性代谢物和53种挥发性化合物。碳水化合物和氨基酸代谢对冷冻贮藏产生响应。在12个月的贮藏期内，脂肪酸组成保持稳定。本研究整合非靶向极性代谢组学、挥发性物质谱、脂肪酸组成、理化属性及通路分析，系统表征了猫山王榴莲在-20°C下冷冻贮藏12个月期间的生化变化。研究人员采用完全随机设计，设置5个贮藏时长（0、3、6、9、12个月），每个时长6个生物学重复。结果表明，可滴定酸度（TA）显著下降26.9%，还原糖和糖酸比（SSC/TA）分别显著上升20%和39.2%，而硬度和可溶性固形物含量（SSC）无显著变化。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）鉴定出19种极性代谢物和13种挥发性标志物（变量重要性投影VIP≥1），其中柠檬酸、D-甘露糖、蔗糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸等显著变化。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、半乳糖代谢以及乙醛酸和二羧酸代谢三条通路显著富集。9种脂肪酸的相对百分比组成在12个月冷冻贮藏期间均无显著变化（FDR校正P>0.05）。多因子分析（MFA）显示，0和3个月样品位置接近，6个月时发生显著位移，9和12个月呈现部分回返轨迹，表明12个月贮藏期内呈非单调变化模式。研究人员指出，观察到的变化反映了长期冷冻贮藏与后续解冻过程的综合效应，未来需结合感官评价和目标验证以建立标志物与感知品质之间的关联。
论文解读文章
一、研究背景与意义
榴莲（Durio zibethinus Murr）被誉为"水果之王"，是东南亚地区极具经济价值的热带水果。猫山王榴莲（Musang King durian, MKD）作为马来西亚的高价值商业品种，以其独特的香气和奶油质地深受国际市场青睐。然而，与许多呼吸跃变型果实一样，榴莲采后因高含水量和旺盛的代谢活动而迅速品质劣变，采后管理至关重要。为延长榴莲在非产季的供应期，马来西亚榴莲产业采用-110°C低温冷冻2小时、随后-20°C冷冻贮藏的工艺。低温冷冻直接使果实暴露于低温环境，缩短冰晶生长时间，从而减少果实结构损伤。然而，后续冷冻贮藏仍可能伴随理化及生化组成变化。
已有研究虽报道了榴莲长期贮藏期间的目标代谢物变化，但多为靶向分析，对贮藏时长本身引起的潜在生化变化认知有限。特别是极性代谢物和脂肪酸在榴莲长期冷冻贮藏过程中的时间动态行为仍缺乏系统表征。因此，本研究旨在整合非靶向极性代谢组学、挥发性物质谱、脂肪酸组成、理化属性及通路分析，系统阐明猫山王榴莲果实12个月冷冻贮藏期间的生化变化及其机制。
二、主要研究结论
研究结果表明，长期冷冻贮藏显著影响猫山王榴莲果实的理化性质和代谢物组成。可滴定酸度（TA）在12个月贮藏期内显著下降26.9%，还原糖和糖酸比（SSC/TA）分别显著上升20%和39.2%，而硬度和可溶性固形物含量（SSC）未受显著影响。非靶向气相色谱-高分辨质谱（GC-HRMS）分析共鉴定出41种极性代谢物、53种挥发性化合物（VOCs）和9种脂肪酸。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）解析出19种极性代谢物和13种挥发性标志物（VIP≥1），这些标志物与榴莲风味直接相关。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、半乳糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢三条通路显著富集。脂肪酸相对百分比组成在12个月冷冻贮藏期间保持稳定，但绝对含量的变化无法排除。多因子分析（MFA）整合四类数据集显示，0和3个月样品位置接近，6个月时发生显著位移，9和12个月呈现部分回返轨迹，表明12个月贮藏期内呈非单调变化模式。
三、关键技术方法
研究人员从马来西亚彭亨州劳勿的商业果园采集自然脱落的完熟猫山王榴莲果实（N=30），果实均重1.4±0.2 kg，无机械损伤和可见缺陷。实验采用完全随机设计，设置5个贮藏时长（0、3、6、9、12个月），每个时长6个生物学重复，每个果实构成一个生物学重复。完整果实经-110°C低温冷冻2小时，验证中心温度达-19.5至-19.8°C后，置于聚苯乙烯箱中密封，于-20°C贮藏至12个月。每3个月取样一次，果实于25±1°C解冻2小时后，收集五个心室果肉合并为复合样本。主要技术方法包括：质地分析仪测定果肉硬度，pH计测定pH值，手持数字折光仪测定可溶性固形物含量（SSC），酸碱滴定法测定可滴定酸度（TA）；采用固相微萃取（SPME）结合Q-Exactive Orbitrap质谱仪进行非靶向挥发性化合物（VOCs）分析；采用气相色谱-高分辨质谱（GC-HRMS）进行极性代谢物分析，代谢物经甲氧胺化和三甲基硅烷化衍生化处理，通过与NIST17数据库及自建标准品库比对确认鉴定（MSI level 2）；脂肪酸经提取和甲酯化（FAMEs）后由GC-HRMS测定相对百分比组成。数据分析采用主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA，VIP≥1）、方差分析（ANOVA）及Tukey's HSD检验（P<0.05）、Kruskal-Wallis检验、KEGG通路富集分析及多因子分析（MFA）。
四、研究结果
4.1 猫山王榴莲长期冷冻贮藏期间理化品质属性的演变
方差分析（ANOVA）结果显示，果肉硬度和可溶性固形物含量（SSC）在贮藏期间无显著变化（P<0.05），这可能归因于低温快速冷冻形成细小冰晶、减少细胞损伤。而可滴定酸度（TA）、还原糖和糖酸比（SSC/TA）随贮藏时间延长发生显著变化：TA在12个月内显著下降26.9%，还原糖和SSC/TA分别显著上升20%和39.2%。pH呈非线性响应，3个月时轻微下降，6和9个月时上升。TA下降和pH轻微上升反映有机酸库的逐渐变化，可能与其在解冻过程中的降解有关；还原糖增加可能归因于果实中非还原糖向还原糖的转化，与TA下降共同促成SSC/TA在3个月后上升。
4.2 猫山王榴莲长期冷冻贮藏期间的代谢物谱
4.2.1 主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）
主成分分析（PCA）显示前两个主成分捕获54.8%的累计变异，样品按贮藏时长呈现明显分离，表明长期冷冻贮藏与代谢物组成的显著变异相关，但0和3个月样品聚集在一起。层次聚类分析（HCA）和热图分析显示，0至3个月样品中多数代谢物相对峰面积变化最小，包括D-甘露糖、山梨糖异构体1、氨基乙酰丙酸、谷氨酸、3-羟基脯氨酸、甲基半乳糖苷、D-手性肌醇、L-天冬氨酸、甘露糖-6-磷酸、柠檬酸、半乳糖二酸和苹果酸；而9至12个月样品中氨基乙酰丙酸、L-天冬氨酸、D-甘露糖、L-丝氨酸、谷氨酸、甘油酸、甘油、木糖、羟基脯氨酸、帕拉金糖、蔗糖和葡糖酸的相对丰度显著上升，苹果酸、甘露糖-6-磷酸和柠檬酸则下调。
4.2.2 判别代谢物鉴定
偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型显示R2和Q2值均高于0.7，1000次置换检验p<0.001，表明模型无过拟合。基于VIP≥1筛选出19种判别代谢物，主要包括8种糖类、3种氨基酸及其衍生物、4种有机酸、2种糖醇、1种核苷和1种胺类。L-天冬氨酸、谷氨酸和3-羟基脯氨酸的相对丰度随贮藏时间显著增加（P<0.05）。研究人员认为，这种增加更可能源于冷冻诱导的组织破裂及后续解冻过程中的蛋白水解降解，而非冷冻贮藏期间活跃的应激代谢，因为在-20°C下细胞代谢基本停滞。糖类中D-甘露糖、蔗糖、山梨糖异构体、帕拉金糖、D-木糖、甲基半乳糖苷显著增加，甘露糖-6-磷酸下降。蔗糖的显著增加可能与其作为冷冻保护剂稳定细胞膜和维持渗透平衡的作用一致，也可能反映冰晶形成导致细胞内可溶性糖释放增加。有机酸中琥珀酸、D-葡糖酸和甘油酸显著增加，柠檬酸显著下降至贮藏结束。柠檬酸下降与可滴定酸度（TA）下降一致，可能反映冷冻诱导组织破裂和残余酶活性导致的有机酸库变化。
4.2.3 关键判别代谢物的KEGG富集分析
KEGG通路富集分析显示三条代谢通路高度富集（-log(P)>2.5，P<0.05）：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；半乳糖代谢；乙醛酸和二羧酸代谢。谷氨酸和天冬氨酸可通过转氨作用与三羧酸循环（TCA）中间体2-酮戊二酸相互转化；琥珀酸和甘油酸是乙醛酸和二羧酸通路及TCA循环的共同标志物；柠檬酸作为TCA循环的中心中间体，为有机酸相对丰度变化提供了生化背景。与碳水化合物代谢相关的判别代谢物包括蔗糖、D-葡糖酸、甘露糖-6-磷酸、D-甘露糖和D-木糖，均映射至半乳糖代谢通路。研究人员强调，通路富集基于代谢物映射识别生化关联，并不建立代谢变化的方向。
4.3 猫山王榴莲贮藏期间顶空挥发性有机化合物（VOCs）指纹
4.3.1 主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）
顶空挥发性有机化合物（VOCs）组成包括酯类、硫化合物、醇类、醛类和酮类，其中硫化合物和酯类为优势类群。主成分分析（PCA）显示前两个主成分解释63%的累计方差，不同贮藏时长的样品呈现明显分离，9和12个月样品聚集在一起。层次聚类分析（HCA）和热图分析显示，0和9个月样品聚为一组，3、6和12个月样品形成另一簇。导致3、6和12个月簇分离的挥发性化合物包括4-乙基-5-甲基-1,3-噻唑、2-硫代丙酸、2-(乙基硫烷基)丙烷、S-乙基乙二硫代酸酯、(乙基三硫烷基)乙烷、3,4-二甲基己-5-烯-3-醇、3,5-二甲基-1,2,4-三硫杂环戊烷、2,4-二甲基戊-3-醇、3-乙基-5-甲基-1,2,4-三硫杂环戊烷和3-羟基丁酸乙酯，这些化合物在3、6、12个月增加而在0和9个月减少，反映了硫化合物和醇类挥发性物质随贮藏时间的演变。
4.3.2 猫山王榴莲冷冻贮藏期间的判别挥发性有机化合物
偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型经交叉验证R2和Q2值均超过0.7，1000次置换检验p<0.001。基于VIP≥1.0筛选出13种判别挥发性标志物。丁酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、丙酸乙酯和丁酸乙酯等酯类化合物的相对峰面积随贮藏时间增加而下降，这些化合物是榴莲果香和甜香风味的贡献者。值得注意的是，辛酸甲酯和己酸甲酯在贮藏6个月后才被检出，表明冷冻贮藏对酯类的响应具有化合物依赖性，其后期检出可能反映冰重结晶导致细胞结构渐进破坏，促进解冻过程中挥发性物质的释放。
4.4 猫山王榴莲贮藏期间的脂肪酸组成
单因素方差分析（ANOVA）/Kruskal-Wallis分析显示，9种脂肪酸的相对百分比组成在整个12个月冷冻贮藏期间均无显著差异（FDR校正P>0.05），表明各脂肪酸对总脂肪酸谱的比例贡献在贮藏期间保持相对稳定。但研究人员指出，当前研究仅评估相对百分比组成而非绝对浓度，因此各脂肪酸绝对含量的变化无法排除。类似稳定性已在-22°C贮藏9个月的甜玉米和-4°C贮藏3周的橄榄油品种中报道，表明脂肪酸组成在持续零下贮藏条件下具有抗变化性。
4.5 理化与代谢组学属性对长期冷冻贮藏的整合响应
多因子分析（MFA）整合脂肪酸、挥发性有机化合物、代谢物和理化参数四类数据集，前两个维度解释75%的总方差（维度1=47.6%，维度2=27.4%）。样品轨迹显示0和3个月样品位置接近，表明早期贮藏阶段整体化学变化有限；6个月时发生显著位移，9和12个月呈现部分回返轨迹，表明12个月贮藏期内呈非单调变化模式。组贡献图显示挥发性化合物和代谢物块是维度1的主要贡献者，而理化属性和脂肪酸块主要贡献于维度2，表明贮藏时长与中心代谢物和挥发性化合物组成变化相关，而理化属性和脂肪酸组成代表相对不同的变异维度。研究人员强调，所有样品均采用固定的2小时25±1°C解冻程序，观察到的差异代表贮藏时长与后续解冻的联合效应，解冻的贡献无法完全排除，未来研究应纳入无解冻对照或采用包含贮藏和解冻条件的析因设计。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，长期冷冻贮藏显著影响猫山王榴莲果实的理化性质和代谢物组成。可滴定酸度（TA）、pH、还原糖和糖酸比（SSC/TA）随贮藏时间显著变化，而硬度和可溶性固形物含量（SSC）保持不变。非靶向GC-Orbitrap-HRMS分析鉴定出41种极性代谢物、53种挥发性化合物和9种脂肪酸。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）解析出13种与榴莲风味直接相关的标志物，包括柠檬酸、木糖、D-甘露糖、蔗糖、L-天冬氨酸、异麦芽糖、内消旋赤藓糖醇、L-谷氨酸、丁酸乙酯、丁酸甲酯、丙酸乙酯和2-乙基二硫烷基丁烷，这些标志物随贮藏时间显著变化。脂肪酸相对百分比组成在整个冷冻贮藏期间无显著变化，但绝对含量变化无法排除。整合多因子分析（MFA）显示0和3个月样品位置接近，6个月时发生显著位移，表明12个月贮藏期内呈非单调变化模式。
研究结论为：代谢物谱为长期冷冻贮藏猫山王榴莲果实的生化变化提供了深入见解，但需认识到观察到的变化反映长期冷冻贮藏与后续解冻过程的综合效应。本研究未包含感官评价，因此无法建立代谢物丰度与人类感知品质之间的直接关联。此外，19种极性代谢物和13种判别挥发性标志物均为MSI level 2推定鉴定，未经真实参考标准品确认。未来研究需整合感官评价和目标验证候选标志物，以建立其与感知品质的关系并评估其在工业场景中的适用性。
