油茶花酚类化合物分离鉴定及Nobotanin D通过PI3K/AKT通路调控脂质积累的作用机制研究

《Journal of Functional Foods》：Isolation and characterization of phenolic compounds from Camellia polyodonta flowers: Nobotanin D attenuates lipid accumulation via PI3K/AKT-mediated regulation

　　

本研究从油茶花（Camellia polyodonta）中分离鉴定了七种酚类化合物，其中Nobotanin D为首次报道。利用油酸诱导的脂肪变性HepG2细胞模型评估了这些化合物的降脂活性，发现Nobotanin D效果最为显著。转录组学分析揭示PI3K/AKT信号通路为关键富集通路。进一步研究表明，Nobotanin D通过激活PI3K/AKT通路，调节下游FOXO1、SREBP-1c、ApoC-III及MTP等脂代谢相关蛋白的表达，减少细胞内甘油三酯（TG）积累并改善脂蛋白代谢。同时，Nobotanin D显著提升超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性及谷胱甘肽（GSH）水平，降低丙二醛（MDA）含量，缓解氧化应激；并通过上调Bcl-2、下调Bax表达抑制细胞凋亡。研究结果表明，Nobotanin D兼具减少脂质沉积与细胞保护的双重作用，为油茶花作为功能性食品原料的开发提供了科学依据，并为高脂血症及相关代谢疾病的干预提供了潜在候选化合物。

研究背景与科学问题

高脂血症是以血浆脂质水平异常升高为特征的代谢性疾病，临床表现为甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）或低密度脂蛋白（LDL）水平升高，可导致动脉粥样硬化、冠心病、脑梗死等多种心血管并发症，并与糖尿病、胰岛素抵抗及肥胖密切相关。目前临床上广泛使用的他汀类和贝特类降脂药物长期应用常伴随肝毒性、肌病及耐药性等不良反应。因此，寻找安全有效的天然降脂替代物成为研究热点。酚类化合物作为植物次生代谢产物，已被证实具有显著的脂质调节活性，其机制涉及抑制肠道胆固醇吸收、增强逆向胆固醇转运及促进肝脏胆固醇摄取等途径。油茶花（Camellia polyodonta）是一种独特的油茶种质资源，花产量高且富含多酚，但其花朵资源在花季后大多凋落腐烂或被废弃，未得到充分利用。已有研究表明油茶花粗提物具有抗氧化和降血脂活性，但对其中单体酚类化合物的系统分离、结构鉴定及活性筛选仍存在空白。基于此，本研究旨在从油茶花活性部位中系统分离并鉴定酚类单体化合物，筛选具有降脂活性的成分，并深入阐明其分子机制。

研究内容与主要结论

研究人员从油茶花20%乙醇洗脱部位中分离纯化出七种酚类化合物，分别为原花青素B4（Procyanidin B4）、原花青素B2（Procyanidin B2）、1,2,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖（1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose）、表儿茶素（Epicatechin）、原花青素C1（Procyanidin C1）、Nobotanin D及1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖（1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose）。其中Nobotanin D为首次从油茶花中分离获得，且分离得量最高（3010 mg）。在油酸诱导的脂肪变性HepG2细胞模型中，所有化合物均不同程度地降低了细胞内TG和TC水平，其中Nobotanin D表现出最强的降脂活性，其降低TC的效果优于阳性对照药辛伐他汀。转录组学分析表明，PI3K/AKT信号通路在Nobotanin D处理组中显著富集。机制研究发现，Nobotanin D显著提高PI3K和AKT的磷酸化水平，增强FOXO1的磷酸化，同时降低SREBP-1c、ApoC-III及MTP的表达，从而协同调控脂质合成与脂蛋白代谢，减少细胞内脂质积累。此外，Nobotanin D显著提升了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性及谷胱甘肽（GSH）水平，降低了丙二醛（MDA）含量，缓解了氧化应激；并通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2、下调促凋亡蛋白Bax的表达，抑制了细胞凋亡。该研究揭示了Nobotanin D通过激活PI3K/AKT通路，调节FOXO1、SREBP-1c、ApoC-III及MTP等下游靶点，发挥“减少脂质沉积与细胞保护”双重作用，从而改善高脂血症代谢紊乱。

关键技术方法

研究人员采用AB-8大孔树脂色谱对油茶花70%甲醇提取物进行分级，收集20%乙醇洗脱组分；随后利用制备型高效液相色谱（preparative HPLC）对该组分进行分离纯化，经多次重复制备色谱及C₁₈柱富集、脱酸、浓缩和干燥，获得七个单体化合物。化合物结构通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）和核磁共振波谱（NMR，包括¹H NMR和¹³C NMR）进行鉴定。体外降脂活性评价采用油酸诱导的脂肪变性HepG2细胞模型，检测细胞内TG、TC含量及油红O染色。转录组测序（RNA-seq）用于揭示差异表达基因（DEGs）及富集的信号通路。实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证基因表达变化，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测PI3K、AKT、FOXO1及其磷酸化水平，以及SREBP-1c、ApoC-III、MTP、Bax、Bcl-2等蛋白表达。氧化应激指标通过商业试剂盒检测SOD、CAT活性及GSH、MDA水平。

研究结果

3.1 从CPFP-II中分离、纯化和鉴定了七种主要酚类化合物

从油茶花20%乙醇洗脱组分中分离得到七种多酚化合物，通过MS和NMR分析鉴定其结构，分别为原花青素B4、原花青素B2、1,2,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖、表儿茶素、原花青素C1、Nobotanin D和1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。其中Nobotanin D的分离得量最高，达3010 mg。

3.2 Nobotanin D是CPFP-II中最有效的降脂酚类成分

在油酸诱导的脂肪变性HepG2细胞模型中，七种化合物均能降低细胞内TG和TC含量。在安全浓度范围内，Nobotanin D表现出最强的TG和TC降低效果，且在降低TC方面显著优于辛伐他汀阳性对照组。因此，选择5 μg/mL Nobotanin D进行后续转录组学分析。

3.3 转录组学分析揭示PI3K/AKT信号通路为关键富集通路

转录组测序结果显示，与模型组相比，Nobotanin D处理组共有220个显著差异表达基因（DEGs），其中154个上调、66个下调。KEGG富集分析表明，PI3K-Akt信号通路和黏着斑在模型组与Nobotanin D组的比较中均显著富集。RT-qPCR验证了10个随机挑选的DEGs的表达趋势与转录组数据一致。

3.4 Nobotanin D调节油酸诱导脂肪变性HepG2细胞中的PI3K/AKT/FOXO1信号通路

Nobotanin D显著提高了PI3K和AKT的mRNA及总蛋白水平，并显著增强了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，表明其促进了PI3K/AKT通路的磷酸化激活。同时，Nobotanin D降低了FOXO1的mRNA和总蛋白水平，并显著提高了p-FOXO1/FOXO1比值。此外，Nobotanin D显著降低了脂质合成关键转录因子SREBP-1c以及脂蛋白代谢相关蛋白ApoC-III和MTP的表达。

3.5 Nobotanin D缓解油酸处理HepG2细胞的氧化应激

与模型组相比，Nobotanin D处理组显著提高了SOD和CAT活性及GSH水平，并显著降低了MDA含量，表明其能够恢复细胞内的氧化还原平衡。

3.6 Nobotanin D降低油酸处理HepG2细胞的凋亡水平

Nobotanin D处理显著上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，下调了促凋亡蛋白Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值从模型组的0.29显著提升至0.49，表明其具有抑制细胞凋亡的作用。

讨论与结论

研究人员指出，本研究首次从油茶花中分离出Nobotanin D，并发现其具有显著的降脂活性，且分离得量较高，为其作为功能性食品原料的开发提供了物质基础。Nobotanin D通过激活PI3K/AKT信号通路，增强FOXO1磷酸化，抑制SREBP-1c介导的脂质从头合成，并下调ApoC-III和MTP的表达，协同减少细胞内TG积累并改善脂蛋白代谢。同时，Nobotanin D通过提升抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化，打破“氧化应激-脂质失调”的恶性循环；并通过上调Bcl-2/Bax比值抑制细胞凋亡，发挥细胞保护作用。研究结论如下：本研究从油茶花20%乙醇洗脱组分中分离鉴定了七种酚类化合物，即原花青素B4、原花青素B2、1,2,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖、表儿茶素、原花青素C1、Nobotanin D和1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。所有化合物均能在不同程度上降低高脂HepG2细胞内的脂质积累，其中Nobotanin D表现出最强的降血脂效果。机制上，Nobotanin D激活了PI3K/AKT信号通路，并调节了FOXO1、SREBP-1c、ApoC-III和MTP的表达，这与油酸诱导的脂肪变性HepG2细胞中细胞内甘油三酯积累的减少和脂蛋白代谢的变化相关。同时，Nobotanin D减轻了氧化应激并抑制了细胞凋亡。综上所述，这些发现证明Nobotanin D发挥“减少脂质沉积与细胞保护”的双重作用，以改善高脂血症代谢紊乱。本研究为油茶花作为功能性食品配料的开发提供了科学依据，并将Nobotanin D确定为治疗高脂血症及相关代谢疾病的一种有前景的化合物。