基于代谢组学与转录组学的副干酪乳杆菌YL-29在Elaeagnus moorcroftii Wall. ex Schlecht果汁中的生长特性研究

《Journal of Future Foods》：Growth characterization of Lacticaseibacillus paracasei YL-29 in Elaeagnus moorcroftii Wall. ex Schlecht juice through metabolomics and transcriptomics

　　

含有棉子糖（raffinose）和果糖（fructose）等物质的Elaeagnus moorcroftii Wall. ex Schlecht果汁（EWSJ）是促进L.cp29生长的潜在益生元。16种差异代谢物和39个差异表达基因（DEGs）促进L.cp29生长；27种差异代谢物和33个DEGs增强EWSJ的功能活性。7种上调差异代谢物通过调控脂肪酸代谢途径促进L.cp29生长。14个关键DEGs的上调增强碳水化合物代谢，进而促进L.cp29生长。肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）、尿苷酸（uridine 5′-monophosphate，UMP）和尿嘧啶（uracil）是氨基酸与核苷酸代谢中具有抗肿瘤和抗炎作用的重要生物活性物质。

随着健康意识的提高，益生菌因改善肠道健康、增强免疫功能和调节肠道菌群而受到广泛关注。乳酸菌发酵可提高果汁的抗氧化活性，并增加黄酮、多酚、有机酸等生物活性成分。Lacticaseibacillus paracasei作为一种革兰氏阳性乳杆菌，具有抗癌特性，并能改善内皮功能和心脏代谢健康，同时参与调控炎症性肠病。然而，源自新疆的副干酪乳杆菌YL-29（L.cp29）对Elaeagnus moorcroftii Wall. ex Schlecht果汁（EWSJ）的影响及其潜在机制此前尚未充分阐明。Elaeagnus moorcroftii Wall. ex Schlecht（EWS）富含水苏糖、棉子糖等碳水化合物及柚皮素、槲皮素等黄酮类物质，被认为是潜在益生元。以往研究多集中于双歧杆菌发酵EWSJ，而关于L.cp29与EWSJ互作的研究较少。为此，研究人员开展了本研究，旨在表征EWSJ对L.cp29生长的影响，并利用非靶向代谢组学与转录组学揭示发酵前后差异代谢物、差异表达基因（DEGs）及其代谢通路的变化，为利用EWS作为益生元提升乳杆菌益生效果提供理论依据。

研究人员将活化后的L.cp29接种于EWSJ中培养48 h，以未接种的EWSJ（EWSK）为对照，测定了活菌数、OD₆₀₀、总酚、总黄酮及抗氧化活性；随后分别取发酵36 h的样本进行非靶向代谢组学和转录组学分析。样本来源方面，EWS果实采自中国新疆喀什（73°20′–79°57′N，35°20′–40°18′E），L.cp29（CCTCC NO: M20221022）分离自新疆伊犁哈萨克儿童粪便，由石河子大学微生物实验室保藏。主要技术方法包括：采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）进行代谢物鉴定与定量；采用RNA测序（RNA-seq）分析转录组；利用OPLS-DA、火山图、KEGG和GO富集分析筛选差异代谢物与DEGs；并通过Spearman相关性分析构建代谢物与基因的关联网络。

研究结果分述如下：

3.1 L.cp29增殖：通过活菌计数和OD₆₀₀测定发现，L.cp29在EWSJ中培养36 h后活菌数达2.63×10⁸ CFU/mL，与MRS培养基组相当甚至略高（P<0.05），表明EWSJ适合L.cp29增殖。

3.2 抗氧化物质含量变化：ABTS和DPPH自由基清除实验显示，发酵后的EWSL（L.cp29发酵EWSJ）其DPPH清除能力显著高于EWSK（P<0.01），ABTS清除活性差异不显著。总可溶性固形物从9.83°Brix降至8.07°Brix（P<0.01），表明糖类被菌株利用。酚酸和总黄酮含量分别从10.52 mg GAE/L和0.87 mg RE/mL增加至26.85 mg GAE/L和1.89 mg RE/mL（P<0.01），说明发酵增强了果汁抗氧化活性。

3.3 代谢组分析：UHPLC-MS/MS非靶向代谢组学在EWSL和EWSK中分别鉴定到1320和1315种代谢物。通过OPLS-DA及火山图筛选出58种差异代谢物，包括氨基酸及其衍生物（10种）、嘌呤及其衍生物（9种）、嘧啶及其衍生物（8种）、碳水化合物及其衍生物（8种）等。KEGG通路注释显示差异代谢物主要富集于核苷酸代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢。

3.4 转录组分析：RNA-seq分析共鉴定到2835个DEGs，其中916个上调、885个下调。KEGG富集分析显示DEGs显著富集于碳水化合物代谢（102个）、膜转运（109个）和核苷酸代谢（135个）等通路。GO富集分析将DEGs分配到20个GO条目，涉及生物学过程和细胞组分。

3.5 代谢和转录差异分析：基于共有代谢通路整合分析，发现58种差异代谢物和382个DEGs共同参与碳水化合物及脂肪酸代谢。

3.5.1 脂肪酸代谢：有8种差异代谢物和7个DEGs同时受调控。fabG和fabZ基因下调导致乙酰辅酶A（acetyl-CoA）积累；4个编码乙酰辅酶A羧化酶的基因（HKJ34_RS05270、HKJ34_RS05250、HKJ34_RS05260、HKJ34_RS05265）上调，可能促进丙二酰辅酶A合成，进而有利于脂肪酸衍生物生成。

3.5.2 碳水化合物代谢：糖酵解相关酶基因（EC 2.7.1.201、EC 3.2.1.93等）上调使海藻糖-6P和D-葡萄糖-6P水平显著下降。编码半乳糖苷酶的HKJ34_RS05390上调，与棉子糖、水苏糖、蔗糖含量降低相关，表明这些低聚糖被菌株利用以促进生长。甘露糖-6-磷酸异构酶（EC 5.3.1.8）基因表达增强，促进果糖和甘露糖代谢，产生短链脂肪酸供菌株生长。

3.5.3 生物活性物质代谢：氨基酸和核苷酸代谢涉及嘌呤代谢、嘧啶代谢、泛酸和辅酶A生物合成、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢及谷胱甘肽代谢。肌苷酸（IMP）积累与Hpt基因下调有关，IMP可抑制肿瘤坏死因子-α并促进白细胞介素-10产生。尿苷酸（UMP）和尿嘧啶为嘧啶代谢关键代谢物，尿嘧啶作为信号分子可能参与细胞增殖、抗菌和抗病毒等过程。

3.6 DEGs与差异代谢物关系：Spearman相关性分析显示，7个差异表达酶基因与脂肪酸及其衍生物相关，37个与碳水化合物及其衍生物相关。脂肪酸合成基因下调导致乙酰辅酶A及其衍生物积累；碳水化合物相关酶基因上调则促进碳水化合物消耗，从而推动L.cp29增殖。

讨论部分总结了碳水化合物和脂肪酸代谢与L.cp29增殖的密切关联：碳水化合物的下调反映其被菌株利用以支持生长，脂肪酸代谢上调则指示菌株生长活跃。此外，嘧啶、嘌呤和氨基酸等生物活性物质赋予发酵液抗菌、抗炎特性，并有助于改善肠道菌群。这些发现证实了EWS益生元效应的潜在机制。

结论部分可翻译为：本研究调查了EWSJ对L.cp29生长的影响，评估了L.cp29基因表达以及EWSJ中碳水化合物和脂肪酸含量的变化。研究人员采用非靶向代谢组学结合转录组学方法，确定了L.cp29发酵EWSJ前后与L.cp29生长和功能活性相关的差异代谢物和DEGs的变化。碳水化合物和脂肪酸及其相应代谢途径与L.cp29增殖相关。碳水化合物的下调表明其被L.cp29生长所利用，脂肪酸的上调则表明L.cp29的生长。此外，检测到嘧啶、嘌呤和氨基酸等生物活性物质，这些物质与EWSL的抗菌、抗炎特性及肠道菌群改善有关。该研究证实了EWS益生元作用的潜在机制，并为未来基于EWS的益生菌作为营养保健品及个性化营养策略组成部分的研究与开发提供了坚实基础。