灵芝酸A通过激活KCNQ2通道改善戊四氮诱导的小鼠癫痫

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Ganoderic Acid A Ameliorates Pentylenetetrazol-Induced Epilepsy in Mice via Activating KCNQ2

　　

本研究旨在探讨灵芝酸A（Ganoderic acid A, GA-A）对戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）诱导的小鼠癫痫的抗癫痫作用，并阐明其潜在机制，重点关注KCNQ2通道。

研究人员采用C57BL/6小鼠和海马特异性KCNQ2基因敲除小鼠建立PTZ诱导的急性癫痫模型。GA-A预处理7天。通过Racine评分和脑电图（electroencephalogram, EEG）评估癫痫发作。通过HE和TUNEL染色检测神经元损伤。通过测定炎症因子和氧化标志物评估神经炎症和氧化应激。通过蛋白芯片、分子对接、表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）和电生理记录验证GA-A与KCNQ2之间的靶向相互作用。

结果：GA-A剂量依赖性地降低了PTZ处理小鼠的癫痫发作严重程度，缩短了癫痫样放电持续时间，减轻了海马神经元丢失和凋亡，并抑制了神经炎症和氧化应激。GA-A直接结合KCNQ2并激活KCNQ2/3通道产生M电流。海马KCNQ2敲除削弱了GA-A对EEG异常及癫痫相关焦虑和抑郁样行为的改善作用，但未影响其抗炎和抗氧化作用。

结论：GA-A通过激活KCNQ2通道抑制神经元过度兴奋，并独立抑制神经炎症和氧化应激，从而减轻PTZ诱导的小鼠癫痫。GA-A是一种有前景的KCNQ2激活剂和抗癫痫药物开发的先导化合物。

癫痫是一种常见的原发性阵发性神经系统慢性疾病，以脑功能短暂障碍为特征。目前治疗以药物为主，但传统抗癫痫药物如苯巴比妥、苯妥英钠、丙戊酸钠等存在嗜睡、头晕、恶心、呕吐等副作用，且约三分之一的难治性癫痫患者无法得到有效控制，疾病复发和长期服药给患者、家庭和社会带来沉重负担。多种癫痫类型常与离子通道功能异常相关，离子通道功能障碍导致神经元兴奋性异常，若不能抑制这种异常兴奋性则引发癫痫。作用于离子通道的抗癫痫药物是临床常用策略，其中KCNQ2/3电压门控钾通道（一种调控神经元兴奋性的钾通道）开放剂是耐药性癫痫的治疗选择之一。首个KCNQ2/3通道激活剂瑞替加滨（retigabine, RTG）于2011年被批准作为耐药性癫痫的辅助治疗药物，但长期使用可导致视网膜色素沉着和视力下降等副作用。2017年以来虽有许多KCNQ2通道激活剂的报道，但分子机制不清，小分子结合口袋不明，阻碍了新药开发。随着KCNQ2/3通道蛋白晶体结构的解析，小分子结合位点和关键氨基酸残基的研究得到极大促进。灵芝（Ganoderma lucidum）是传统中药，其三萜类成分灵芝酸A（Ganoderic acid A, GA-A）具有抗炎、抗肿瘤、调脂和器官保护等活性。前期研究表明灵芝提取物可通过滋养神经、抑制神经炎症、减轻氧化应激改善中枢及外周神经系统疾病；灵芝多糖可抑制钙超载并促进CaMKIIα表达从而保护癫痫神经元；GA-A可减少皮层神经元凋亡、减轻神经炎症、增强线粒体膜抗氧化活性而表现出抗癫痫潜力，但其直接靶点和潜在机制仍不清楚。天然产物治疗疾病疗效确切且不良反应少，但靶点不清限制了应用。为此，研究人员开展了本研究，旨在发现GA-A能否直接激活KCNQ2/3通道并产生M电流，并在动物模型中改善PTZ诱导的癫痫及相关行为异常，从而明确GA-A的抗癫痫作用及直接靶点。

研究人员选用SPF级成年雄性C57BL/6小鼠（19–23 g，每组8只）和海马特异性KCNQ2基因敲除小鼠（通过Cre-loxP系统构建），建立PTZ（50 mg/kg）诱导的急性癫痫模型，GA-A（5、10、20 mg/kg）连续7天腹腔注射预处理。采用Racine评分和脑电图（EEG）评估癫痫发作；HE和TUNEL染色检测神经元损伤；ELISA检测炎症因子和GFAP；生化法检测MDA和NO；HuProt?人蛋白组芯片、分子对接、表面等离子体共振（SPR）和爪蟾卵母细胞全细胞膜片钳记录验证GA-A与KCNQ2的相互作用及通道激活。所有实验随机盲法，p<0.05为差异有统计学意义。

研究结果如下。

3.1 GA-A降低癫痫发作频率和持续时间，抑制PTZ引起的氧化应激和炎症。通过PTZ化学点燃模型发现，GA-A剂量依赖性地延迟和减少癫痫发作的发生与进展，20 mg/kg剂量效果最显著。ELISA显示PTZ显著升高血清IL-6、TNF-α、IL-1β及海马和皮层IFN-γ水平，GA-A各剂量均显著逆转这些升高；GA-A（10、20 mg/kg）显著降低海马MDA和NO水平，并剂量依赖性地降低GFAP表达。这表明GA-A通过减轻神经炎症和星形胶质细胞增生缓解癫痫。

3.2 GA-A减轻PTZ引起的神经元丢失和细胞凋亡。HE染色显示模型组海马椎体细胞层排列紊乱、神经元丢失、核固缩和胞质空泡化，周围实质有炎性细胞浸润，高剂量GA-A使海马形态恢复至接近对照组；TUNEL染色显示GA-A显著减少海马CA1和CA3区凋亡细胞，呈剂量依赖性保护作用。

3.3 GA-A减轻PTZ诱导的癫痫发作并改善焦虑和抑郁样行为。EEG显示GA-A明显减弱PTZ诱导的癫痫样放电。旷场实验（OFT）中各组总运动距离无显著差异，PTZ组中央区停留时间显著缩短，GA-A（20 mg/kg）显著恢复中央区时间；强迫游泳实验（FST）和悬尾实验（TST）中PTZ组不动时间显著延长，GA-A各剂量均显著缩短；新物体识别实验（NOR）中PTZ组识别指数显著降低，GA-A（10、20 mg/kg）剂量依赖性升高识别指数。这表明GA-A可改善癫痫相关的焦虑、抑郁样行为和认知记忆损伤。

3.4 激活KCNQ2可能是GA-A缓解癫痫的靶点之一。HuProt蛋白芯片捕获到GA-A与KCNQ2特异性结合（信噪比36.90，log2信噪比5.21）；Western blot显示PTZ注射和GA-A处理均不改变KCNQ2蛋白表达，提示GA-A可能通过影响通道活性而非表达水平发挥作用。分子对接预测GA-A的羧基与KCNQ2的TYR-98和TYR-95形成两个氢键，并可插入KCNQ2/3通道电压感受结构域S3–S4之间的疏水口袋，结合能为?6.896 kcal/mol；其结合位点与RTG在孔隙结构域S5、孔螺旋和S6形成的口袋中的结合方式不同。SPR测得GA-A与KCNQ2结合的平衡解离常数（KD）为68 nM。爪蟾卵母细胞全细胞膜片钳记录显示，GA-A（0.1–100 μM）浓度依赖性地激活Kv7.2/Kv7.3通道产生M电流，半最大效应浓度（EC₅₀）为4.284 μM（RTG为1.99 μM）。

3.5 Kcnq2敲除不影响GA-A对神经炎症和氧化应激的缓解作用。通过Cre-loxP系统建立海马特异性Kcnq2敲除小鼠，Western blot和免疫组化证实海马KCNQ2缺失，NeuN表达不受影响。在flox/flox小鼠PTZ模型中发现，GA-A延长癫痫达到4级的时间，但未降低最高发作等级；血清IL-6、TNF-α、IL-1β及海马MDA、NO、IFN-γ和皮层IFN-γ及GFAP水平仍被GA-A显著抑制。这说明GA-A抑制神经炎症和氧化应激不依赖KCNQ2。

3.6 Kcnq2敲除削弱了GA-A对EEG和焦虑抑郁样行为的改善作用。在体EEG记录显示，PTZ处理使flox/flox小鼠出现典型高幅高频癫痫放电，GA-A虽降低放电幅度和频率，但改善程度不及野生型；行为学检测显示KCNQ2缺失加剧PTZ小鼠的焦虑抑郁样行为和认知障碍，GA-A未能显著改善这些行为。这表明GA-A改善EEG异常及情绪行为依赖于KCNQ2。

讨论部分，研究人员指出，GA-A通过激活KCNQ2通道抑制神经元过度兴奋，从而减轻癫痫样脑电异常及癫痫相关焦虑抑郁行为；其抗炎和抗氧化作用独立于KCNQ2，提示GA-A通过多通路、多靶点发挥抗癫痫效应。KCNQ2/3通道在皮层、海马等癫痫发生相关脑区高表达，是重要的抗癫痫药物靶点。RTG虽有效但因副作用撤用，而GA-A化学结构中不含RTG的电子富集三胺芳香骨架，长期给药安全性已有报道，因此GA-A是有前景的KCNQ2激活剂和抗癫痫药物先导化合物。该研究局限性包括样本量相对较小、PTZ急性发作模型不能完全模拟人类癫痫的复杂性、GA-A在体内与KCNQ2的直接结合尚未确证。研究结论为：GA-A通过激活KCNQ2通道抑制神经元过度兴奋，并独立抑制神经炎症和氧化应激，从而减轻PTZ诱导的小鼠癫痫；GA-A是一种有前景的KCNQ2激活剂和抗癫痫药物开发的先导化合物。