《Journal of Future Foods》：Preparation of ovomucin glycopeptides and their immunomodulatory effects on macrophages based on metabolomics
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摘要专业翻译：研究人员通过模拟胃肠道消化结合亲和色谱制备了卵粘蛋白糖肽（ovomucin glycopeptides, OVMG），并基于代谢组学（metabolomics）技术研究了其对小鼠巨噬细胞（RAW264.7细胞）的免疫调节作用及潜在机制。结果表明，
摘要专业翻译：研究人员通过模拟胃肠道消化结合亲和色谱制备了卵粘蛋白糖肽（ovomucin glycopeptides, OVMG），并基于代谢组学（metabolomics）技术研究了其对小鼠巨噬细胞（RAW264.7细胞）的免疫调节作用及潜在机制。结果表明，OVMG在测试浓度范围内对RAW264.7细胞无细胞毒性。OVMG以剂量依赖方式刺激一氧化氮（nitric oxide, NO）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的释放，从而激活巨噬细胞。代谢组学分析共鉴定出885种代谢物，其中在低剂量OVMG组与对照组（L-OVMG/Con）和高剂量OVMG组与对照组（H-OVMG/Con）的比较中分别筛选到180个和225个差异代谢物（differential metabolites, DMs），两组间有108个重叠DMs。代谢通路富集分析提示，OVMG可能通过重塑脂质代谢、氨基酸代谢和能量代谢通路来介导巨噬细胞免疫调节。该研究为OVMG作为功能性食品成分和免疫调节剂的开发提供了理论依据。
论文解读文章
**研究背景与目的**
卵粘蛋白（ovomucin, OVM）是蛋清中高度糖基化的蛋白质之一，具有免疫调节、抗氧化及维持稳态等多种生物学活性。在胃肠道消化过程中，OVM可释放大量卵粘蛋白糖肽（ovomucin glycopeptides, OVMG），其由携带寡糖链的OVM多肽片段组成。已有研究表明，植物来源糖肽具有免疫调节、抗炎和镇痛活性；研究人员前期工作也证实蛋清糖肽可通过免疫相关信号通路（如核因子kappa-B和C型凝集素受体）刺激巨噬细胞分泌TNF-α并激活细胞。然而，蛋清糖肽是由多种糖蛋白水解物组成的复杂混合物，前期研究证实OVMG约占总蛋清糖肽的30%，覆盖490个N-糖肽和216个O-糖肽，且糖蛋白上连接的寡糖链可促进抗原呈递细胞对抗原的识别。据此，研究人员推测OVMG是蛋清糖肽免疫调节活性的关键活性成分，但关于OVMG免疫调节作用及其与巨噬细胞代谢通路重塑之间关联的系统研究仍较缺乏。巨噬细胞是先天性和适应性免疫的核心效应细胞，其激活和功能转换受细胞内代谢重编程的调控。因此，从细胞代谢水平探究OVMG的潜在免疫调节机制具有重要意义。本研究旨在制备OVMG，在RAW264.7细胞模型中评估其免疫调节活性，并通过代谢组学初步分析细胞代谢谱变化，为蛋清蛋白的高值化利用及OVMG基功能食品开发提供理论支持。该论文发表于《Journal of Future Foods》。
**关键技术与方法**
研究人员采用实验室既有方法从蛋清中分离OVM，通过模拟胃肠道消化（胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶依次消化）结合伴刀豆球蛋白A（Con A）Sepharose亲和色谱富集制备OVMG，采用SDS-PAGE评估消化效果。以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞（购自中国科学院细胞库）为体外模型，通过CCK-8法检测细胞活力，利用试剂盒测定NO和TNF-α分泌水平，以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）为巨噬细胞激活阳性对照。基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术进行非靶向代谢组学分析，结合主成分分析和KEGG通路富集解析差异代谢物及相关代谢通路。
**研究结果**
**（一）OVMG的制备与表征**
SDS-PAGE电泳分析显示，制备的OVM样品几乎不含卵清蛋白和卵转铁蛋白等主要杂质蛋白，仅残留少量溶菌酶；经体外模拟胃肠道消化后，OVM被水解为37 kDa以下的小肽，并通过亲和色谱成功富集获得OVMG。
**（二）OVMG对RAW264.7细胞活力的影响**
CCK-8检测结果显示，OVMG在12.5-800 μg/mL浓度范围内均未降低细胞活力，其中100和200 μg/mL OVMG显著促进细胞增殖（p < 0.05），表明OVMG对RAW264.7细胞无细胞毒性。考虑到高浓度促增殖可能影响其固有免疫刺激活性，研究人员选择0-50 μg/mL浓度范围开展后续研究。
**（三）OVMG对RAW264.7细胞NO分泌的影响**
与Con组相比，OVMG处理以剂量依赖方式促进NO产生，其中25和50 μg/mL OVMG组的NO水平显著高于对照组（p < 0.05）。与LPS组相比，低浓度OVMG（6.25和12.5 μg/mL）与LPS联合处理显著增强NO分泌，而高浓度OVMG（25和50 μg/mL）与LPS联合处理呈相反趋势，提示OVMG对LPS诱导的NO分泌具有调节作用。OVMG与LPS联合处理的NO水平显著高于单独OVMG处理组，表明两者在NO产生上具有加性效应。
**（四）OVMG对RAW264.7细胞TNF-α分泌的影响**
LPS刺激显著增加TNF-α分泌，达824.48 pg/mL，约为对照组的6倍。OVMG各处理组TNF-α分泌均显著高于对照组（p < 0.05），其中25和50 μg/mL OVMG组与LPS组水平相近。低浓度OVMG与LPS联合处理对TNF-α释放具有加性效应。
**（五）OVMG刺激RAW264.7细胞的代谢组学分析**
共鉴定885种代谢物，以氨基酸及其代谢物（约28.8%）、甘油磷脂（glycerophospholipids, GP，15.5%）和核苷酸及其代谢物（9.8%）为主。PCA分析显示L-OVMG和H-OVMG组与LPS组明显分离，且三组均与Con组显著区分。L-OVMG/Con组筛选出180个DMs（39个上调、141个下调），H-OVMG/Con组225个DMs（86个上调、139个下调），两组间有108个共有DMs。OVMG与LPS对巨噬细胞代谢的调控模式存在差异：OVMG组氨基酸及代谢物类DMs以下调为主，LPS组上下调数量接近；LPS组GP类DMs几乎全部上调，而OVMG组部分下调。
**（六）OVMG通过脂质代谢重塑调控巨噬细胞免疫**
H-OVMG和LPS均显著激活花生四烯酸代谢通路，促进前列腺素（PGD2、PGE2、PGJ2等）和白三烯B4（LTB4）等效应分子产生，同时降低其前体花生四烯酸和失活代谢物12-酮-LTB4水平。在亚油酸和α-亚麻酸代谢中，H-OVMG显著上调9-OxoODE水平，提示可能触发脂质过氧化。此外，OVMG还通过影响磷脂酰胆碱（PC）代谢参与逆行内源性大麻素信号和胆碱代谢通路，促进1-酰基甘油磷脂胆碱积累并限制PC再合成；同时上调磷脂酸（phosphatidic acid, PA）水平，提示可能通过PA依赖性膜信号传导发挥免疫调节作用。
**（七）OVMG通过氨基酸、嘧啶和磷酸戊糖代谢重塑调控巨噬细胞免疫**
在精氨酸生物合成及精氨酸-脯氨酸代谢通路中，OVMG和LPS均显著下调精氨酸并上调下游代谢物腐胺（分别上调4.3、6.7和5.0倍），呈浓度依赖性；H-OVMG和LPS组亚精胺显著下调，说明两者可能抑制腐胺向亚精胺的转化。OVMG还上调L-瓜氨酸和衣康酸水平，提示可能发挥抗炎作用。与LPS激活磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）不同，OVMG导致6-磷酸葡萄糖、2-脱氧核糖-1-磷酸和核糖-1-磷酸显著下调，表现出对PPP的抑制作用。在嘧啶代谢中，OVMG和LPS均触发代谢重编程，上调尿嘧啶和胸苷，下调氨甲酰磷酸，但两者的下游调控模式存在明显差异。
**讨论与结论**
本研究通过体外RAW264.7细胞模型结合代谢组学分析，证实OVMG在适宜浓度下无细胞毒性，可剂量依赖性地促进NO和TNF-α分泌，且对LPS诱导的过度免疫反应具有调节作用。代谢组学揭示OVMG主要通过重塑脂质代谢、精氨酸-瓜氨酸-多胺代谢轴、嘧啶代谢和磷酸戊糖途径来介导巨噬细胞免疫调节，其中精氨酸-瓜氨酸-多胺代谢轴的激活是核心事件，PP途径抑制可能与其抗炎效应相关。该研究为OVMG作为免疫活性成分的功能食品开发和蛋清蛋白高值化利用提供了理论依据。研究结论：OVMG在25-800 μg/mL范围内对RAW264.7细胞无毒，6.25-50 μg/mL可剂量依赖性促进NO和TNF-α分泌；代谢组学分析鉴定出885种代谢物，L-OVMG/Con和H-OVMG/Con组分别有180个和225个DMs，其中108个为共有；OVMG主要通过脂质代谢、精氨酸-瓜氨酸-多胺代谢轴、嘧啶代谢和磷酸戊糖途径的重编程发挥免疫调节作用。
