金针菇多糖纳米脂质体的理化性质与肠道黏液黏附性：粒径与甾醇组成的影响

《Journal of Future Foods》：Physicochemical Properties and Intestinal Mucus Mucoadhesion of Flammulina velutipes Polysaccharide Nanoliposomes: Effects of Particle Size and Sterol Composition

　　

专业术语翻译摘要
金针菇（*Flammulina velutipes*）多糖（FVP）负载脂质体在可控粒径和甾醇组成条件下成功制备。以植物甾醇酯（SE）替代胆固醇（CH）后，脂质体的zeta电位、包封效率和主相变温度均显著提高。载FVP脂质体表现出良好的细胞相容性，并保留免疫刺激活性，其中200 nm制剂诱导的一氧化氮（NO）水平更强。体外实验显示，含SE脂质体在猪肠道黏液中的持续黏附率低于含CH脂质体。甾醇组成和粒径共同影响体内肠道黏膜黏附和组织穿透：SE组呈现更强的穿透趋势，而100 nm脂质体总体表现更优。该研究为亲水性多糖口服递送系统中食品级纳米脂质体的理性设计提供了重要依据。

论文解读文章
**研究背景与问题**
金针菇（*Flammulina velutipes*）是我国广泛栽培的食用真菌，富含多糖、肽类、黄酮等多种生物活性成分。其中金针菇多糖（*Flammulina velutipes* polysaccharide, FVP）因具有免疫调节、抗氧化、抗炎和改善认知等功能而备受关注。已有研究表明，FVP可通过激活巨噬细胞、调节T淋巴细胞亚群及调控肠道菌群等途径发挥免疫调节作用。然而，以往研究多聚焦于FVP的结构特征与生物活性，对其口服递送过程中的行为关注不足。尤其是FVP在肠道环境中的界面行为及其与黏液层的相互作用机制尚不清楚，这成为制约其高效口服递送的关键瓶颈。纳米脂质体因具有磷脂双分子层结构、水性内核、良好生物相容性及同时包载亲水和疏水组分的能力，在食品递送系统中应用广泛。对于FVP这类亲水性多糖，纳米脂质体既能作为保护性载体，也可能影响其与肠道黏液的相互作用。纳米颗粒在到达上皮表面之前，必须穿越肠道黏液屏障；黏液的孔隙结构、电荷特性和动态更新共同影响颗粒的滞留、扩散及界面接触。其中，粒径直接影响颗粒在黏液网络中的扩散能力，较小颗粒通常更容易通过空间位阻屏障。此外，膜甾醇组成可调节双分子层的有序性和稳定性，进而改变脂质体与黏液层的相互作用。胆固醇（cholesterol, CH）是纳米脂质体中最常用的膜甾醇，对调节膜流动性、力学强度和稳定性具有重要作用。但食品递送领域更倾向于寻找可应用性强的天然来源替代膜材料。植物甾醇酯（plant sterol ester, SE）可嵌入脂质双分子层，并被报道能改善体系稳定性和黏液相关行为。由于SE与CH具有相似的甾醇骨架且具有优良的生理功能和食品应用特性，因此被视为有潜力的替代膜甾醇。尽管如此，以SE替代CH对多糖负载纳米脂质体的理化性质和黏液黏附行为的影响尚不明确。为此，研究人员以FVP为活性成分，以CH和SE为膜甾醇组分，制备不同粒径的纳米脂质体，系统评估其理化性质、储存稳定性、体外肠道黏液黏附性、细胞相容性及一氧化氮（nitric oxide, NO）产生能力，并结合大鼠体内分布实验，阐明粒径与甾醇组成对肠道输送行为的影响。研究成果发表于《Journal of Future Foods》。
**主要技术与方法**
研究人员采用逆向蒸发联合超声处理和聚碳酸酯膜挤出技术，制备包载FVP的纳米脂质体。以DPPC、DOTAP与CH或SE按摩尔比20:3:8构建膜结构，分别通过100 nm和200 nm孔径的聚碳酸酯膜挤出，获得四种载FVP脂质体制剂（CH-FVP-LP-100、CH-FVP-LP-200、SE-FVP-LP-100、SE-FVP-LP-200），另设无甾醇对照（FVP-LP-100、FVP-LP-200）。采用动态光散射和电泳光散射测定粒径、聚合物分散指数（polydispersity index, PDI）与zeta电位；通过苯酚-硫酸法测定包封效率；透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察形态；傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）表征官能团；差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）分析膜热相变行为；体外黏液黏附实验使用新鲜猪小肠黏液；RAW 264.7巨噬细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）用于细胞活力和NO测定；体内分布实验以6周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（购自Charles River公司）为模型，经灌胃给予香豆素6（Cou6）标记的脂质体，2小时后取十二指肠、空肠和回肠制备冰冻切片，通过荧光显微镜定量分析黏膜黏附和组织穿透。
**研究结果**
**（1）包封效率、粒径、PDI与zeta电位**：在同一甾醇条件下，100 nm制剂粒径显著小于200 nm制剂，而相同挤出条件下CH与SE组粒径无显著差异，成功建立了内部可比的两个粒径层级。SE组的zeta电位（18.47–19.17 mV）高于CH组（14.70–15.20 mV），包封效率亦高于CH组（61.23%–67.17% vs 49.19%–62.81%）。200 nm制剂包封效率高于对应100 nm制剂，但SE-FVP-LP-100与CH-FVP-LP-200包封效率相近，表明甾醇组成对FVP包封具有重要贡献。
**（2）DSC热分析**：甾醇组成显著影响膜热相变行为。CH脂质体的主相变温度（T_m）为41.88–43.51°C，低于DPPC+DOTAP的49.96°C；SE脂质体的T_m则升高至71.22–72.50°C。在37°C生理温度下，CH脂质体处于相变区间，膜流动性较高；SE脂质体则保持在有序凝胶态，膜刚性更强，可能有利于黏液穿透。
**（3）FTIR表征**：所有制剂均保留磷脂双分子层的特征吸收峰（2917–2920 cm^-1、2850–2851 cm^-1及1737–1738 cm^-1酯羰基带）。FVP在3302 cm^-1附近呈现宽O-H吸收，负载FVP后脂质体对应区域出现多糖特征吸收峰，说明FVP成功包载，且以物理包封和非共价作用为主，未破坏基本膜结构。
**（4）储存稳定性**：4°C储存15天后，甾醇组成主要影响粒径保持和zeta电位，粒径主要影响PDI。在200 nm组中，SE制剂粒径增长幅度小于CH制剂；100 nm制剂PDI变化低于200 nm制剂。各制剂zeta电位在储存期间无显著变化，整体稳定性满足后续生物学比较需求。
**（5）免疫活性**：CCK-8实验显示，所有脂质体处理组细胞活力维持在对照组的98.1%–136.1%，无显著差异，表明载体细胞相容性良好。NO测定中，空白脂质体未诱导巨噬细胞活化，FVP本身显著增加NO产生（79.83%±5.78%）。包载后脂质体仍可诱导NO产生（24.42%–57.69%），但低于游离FVP，可能因为脂质体包封延缓了FVP释放。两种甾醇体系中，200 nm制剂诱导的NO水平均高于对应100 nm制剂，其中SE-FVP-LP-200均值最高（57.65%±1.18%）。
**（6）体外猪黏液黏附**：所有制剂在5分钟内快速黏附于猪小肠黏液，峰值黏附率达90.61%–93.36%。随后CH组黏附率下降缓慢，60分钟时仍维持在85%左右；SE组在峰值后明显下降，SE-FVP-LP-100在5–60分钟间降幅达26.12%，最终黏附率仅70.47%–77.66%。该结果表明，CH利于持续滞留，SE则可能因膜刚性增强而降低黏液截留。
**（7）SD大鼠体内肠道分布**：灌胃2小时后，含甾醇脂质体在所有肠道节段的黏膜黏附和组织穿透信号均强于无甾醇脂质体。空肠的黏膜相关荧光和组织穿透强度普遍高于十二指肠和回肠。100 nm制剂总体荧光强度高于对应200 nm制剂。SE组相对CH组呈现更高的黏膜穿透趋势，但未达统计学显著差异。粒径效应与体外巨噬细胞实验不同：100 nm更利于肠道传输，而200 nm在细胞层面激活更强，说明粒径作用依赖具体生物屏障和评价终点。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，甾醇组成可协同调控表面静电环境和膜相态：SE制剂较高的positive zeta电位促进其初始静电结合黏液，而后续黏附快速下降与其有序凝胶态膜有关。刚性更强的双分子层有利于颗粒在黏液网络中运动并进入上皮组织。粒径方面，100 nm脂质体在体内表现出更好的黏膜黏附和组织穿透，而200 nm制剂在巨噬细胞中诱导更强的NO反应，差异可能源于细胞直接暴露与口服肠道传输涉及的不同生物过程。研究结论强调，用SE替代CH可提高zeta电位和包封效率，显著改变膜热相态；SE制剂倾向于降低黏液持续滞留、增强肠道组织穿透，100 nm粒径总体更有利于体内肠道分布。这些发现为亲水性多糖脂质体口服递送系统的结构与功能优化提供了依据。研究人员同时指出，免疫活性仅经体外评估，体内分布仅考察2小时单一时间点；未来将通过多时间点实验阐明黏液黏附、组织穿透和FVP释放行为的时序特征及其与免疫调节活性的机制关联。