# 液体乳基质对适配体检测的干扰机制及消除策略的系统性研究

《Journal of Future Foods》：Influence Mechanisms of Liquid Milk Matrix on Aptamer-based Detection and Corresponding Elimination Methods

　　

适配体是采用体外筛选技术（即配体指数富集系统进化（SELEX））获得的短链单链DNA或RNA序列，能够以高亲和力和特异性与金属离子、小有机分子乃至完整细胞等靶标分子结合。相较于抗体或其他检测元件，适配体具有合成成本低、稳定性好、易于化学修饰及靶标筛选范围广等优势，因此在生物传感、疾病诊断和环境监测等领域展现出巨大潜力。尤其是在快速食品安全检测领域，适配体传感器被广泛用于病原微生物、毒素、农药或兽药残留及过敏原等危险因子的检测。然而，适配体实际应用的主要障碍在于其性能易受复杂样品基质的影响。样品基质中存在的非靶标物质可能通过非特异性吸附、竞争性结合或产生背景信号等方式干扰适配体与靶标分子的特异性识别，导致检测信号失真、灵敏度降低或出现假阳性/假阴性结果。这一瓶颈严重限制了适配体传感器在现场和工业应用中的发展。因此，深入理解基质干扰的本质并开发有效的应对策略已成为该领域亟待解决的问题。

液态乳作为一种典型的油包水乳液，因其成分复杂、工业检测需求迫切且现有综述存在公认的局限性，被选为本综述相较于其他食品基质的关注焦点，是研究适配体传感中基质干扰的理想模型体系。其主要成分（酪蛋白胶束、可溶性乳清蛋白、膜包裹的脂肪球、乳糖、矿物质、维生素和生物活性物质）会显著干扰基于光学、电化学等原理的适配体传感器。例如，高浓度蛋白质和脂质在传感器表面产生非特异性吸附并占据活性位点；浊度和内源性荧光掩盖光学检测信号；大分子胶体网络阻碍靶标分析物的传质；核酸酶、金属离子或氧化还原活性成分直接影响适配体稳定性或催化反应。尽管乳基质对适配体传感器性能的不利影响日益被认识，但现有综述要么侧重于广谱食品基质，要么侧重于特定方法，缺乏对物理化学干扰机制的系统分析，也未能提供按靶标类型分类基质效应并匹配相应抗干扰策略的机制框架，同时缺乏对长期稳定性、不同乳源间重现性、工业规模化应用及基质干扰评估标准化方案的严格评价，进一步阻碍了跨实验室比较和监管认可。本综述聚焦于各种商业形式的液态乳（原料乳、巴氏杀菌乳、超高温灭菌（UHT）乳和脱脂乳），并参考奶粉、婴幼儿配方乳粉或其他食品基质作为策略机制可迁移至液态乳检测的补充证据。

本工作旨在系统综述液态乳基质影响适配体检测的机制及其消除方法。与现有综述不同，本工作建立了将特定干扰模式（如非特异性吸附、光学背景、传质阻碍和化学干扰）与靶标物理化学性质相关联的机制分类框架，从而能够选择合理策略而非经验性试错方法。首先分析了乳基质的组成特征及其干扰适配体检测的潜在物理化学原理；其次，根据分析物类型（如食源性病原体等微生物、过敏原和功能性蛋白等生物大分子、抗生素、真菌毒素和重金属等小分子/离子）分类评述了当前文献中报道的各种抗干扰策略，涵盖从样品前处理、传感界面设计到信号放大和集成检测的全过程优化。这种分类讨论基于以下核心概念：基质所面临的挑战以及不同尺度和性质靶标分析物的响应逻辑存在本质差异，这种结构化综述更清晰地揭示了策略背后的设计原理和适用边界。重要的是，本综述不仅总结了单项研究，还批判性比较了不同传感策略的优势、局限性和适用性，指出磁分离对捕获微生物高度有效，但对小分子效果较差；相反，级联放大对于检测痕量小分子至关重要，但对于天然定位信号的微生物捕获往往并非必需。最后，总结了该领域面临的挑战并概述了未来可能的发展方向。本文为研究人员根据其具体检测需求选择和设计适配体传感器提供了方法论指导。

# 液体乳基质对适配体检测的干扰机制及消除策略研究解读

## 一、研究背景与问题提出

适配体是经SELEX技术筛选获得的短链单链DNA或RNA序列，能够以高亲和力和特异性与金属离子、小分子有机物乃至完整细胞等靶标结合。相较于抗体，适配体具有合成成本低、稳定性好、易于化学修饰和靶标谱广等优势，在生物传感、疾病诊断和环境监测领域应用前景广阔，尤其在食品安全快速检测中被广泛用于病原微生物、毒素、农兽药残留和过敏原的检测。然而，适配体的实际应用长期受制于一个关键瓶颈——复杂样品基质的干扰效应。基质中的非靶标物质可通过非特异性吸附、竞争性结合或背景信号产生等方式干扰适配体-靶标特异性识别，导致信号失真、灵敏度下降和假阳性/假阴性结果。

液态乳作为一种成分高度复杂的天然水包油乳液，其酪蛋白胶束、乳清蛋白、脂肪球、乳糖、矿物质、维生素及内源酶等组分对基于光学、电化学等原理的适配体传感器构成显著干扰，具体表现在：高浓度蛋白和脂质在传感界面的非特异性吸附；浊度和内源荧光对光学信号的掩蔽；胶体网络对靶标传质的阻碍；以及核酸酶、金属离子和氧化还原活性物质对适配体稳定性和催化反应的化学干扰。然而，现有综述存在明显不足：多聚焦于广谱食品基质或特定方法，缺乏对物理化学干扰机制的系统分析，未能按靶标类型建立基质效应分类与抗干扰策略匹配的机制框架，且缺失对长期稳定性、跨乳源重现性、工业可扩展性和标准化评估方案的严格评价，阻碍了跨实验室比较与监管认可。因此，本研究旨在系统阐明液态乳基质干扰适配体检测的机制，建立靶标导向的抗干扰策略分类框架，为实际应用提供方法论指导。

## 二、研究内容与主要技术方法

研究人员围绕液态乳基质干扰适配体检测的机制与消除策略开展了系统综述研究，建立了机制-策略对应框架。研究所涉及的主要技术方法包括：磁分离技术，利用适配体功能化磁珠在磁场下实现靶标从复杂基质中的快速富集与物理隔离；两性离子抗污染界面工程，如聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（pSBMA）改性拭子用于抵抗非特异性蛋白吸附；级联信号放大技术，涵盖核酸外切酶辅助循环放大、滚环扩增（RCA）、DNA步行器和CRISPR-Cas系统等痕量检测手段；以及多种光学和电化学传感模式，包括比色法、荧光法、光热法、表面增强拉曼散射（SERS）、场效应晶体管（FET）和光电化学分析等。

## 三、研究结果与结论

### 1. 液态乳基质的组成复杂性及其干扰原理

研究人员分析了原料乳、巴氏杀菌乳、UHT乳和脱脂乳等不同商业形式液态乳的组分差异，指出酪蛋白胶束约占乳蛋白的80%，形成100-200 nm的球形聚集体，带有负电荷表面位点，可通过静电和疏水作用与适配体发生非特异性结合并物理扭曲适配体二级结构；乳清蛋白（主要为β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）具有多样的等电点和疏水口袋，促进与适配体链的非特异性缔合；脂肪球（0.1-10 μm）由磷脂蛋白膜包裹，引入强疏水作用，驱动适配体碱基的疏水吸附并形成阻碍传质的屏障层。热加工处理会加剧上述效应：变性乳清蛋白和聚集酪蛋白增强蛋白冠形成，升高的脂肪含量增强光学背景，更大的胶体网络放大扩散阻碍。在分子水平上，疏水作用力、静电相互作用、氢键和范德华力四种非共价相互作用在不同组分间差异性地发挥作用。特别值得注意的是，多数干扰研究使用模拟乳而非真实原料乳，导致机制认识存在空白，因此使用多批次真实原料乳进行验证必不可少。

### 2. 四种主要干扰机制及其协同效应

研究人员将液态乳基质对适配体检测的干扰归纳为四种主要机制。第一，非特异性吸附是最普遍的干扰模式，高浓度蛋白和脂质通过疏水和静电作用快速吸附至传感界面或纳米探针表面形成蛋白冠，阻断适配体识别位点、掩蔽活性组分并阻碍电子或能量转移，可导致高达80%的信号损失。酪蛋白胶束和乳清蛋白是主要贡献者。第二，光学背景干扰主要影响荧光、比色、拉曼和化学发光方法，酪蛋白胶束和脂肪球的强光散射抬高背景吸光度，内源性核黄素在370/530 nm和445/535 nm处产生自发荧光峰，乳品固有颜色掩蔽弱比色变化。第三，传质阻碍与位阻屏蔽源于酪蛋白胶束和脂肪球形成的三维胶体网络，物理阻碍靶标分析物（特别是细菌等大颗粒）向传感界面的扩散，蛋白冠额外引入的位阻屏障可阻碍适配体-靶标识别。第四，化学干扰涉及基质组分对传感反应系统的直接物理化学效应，包括金属离子（Ca2?、Mg2?、Zn2?）与适配体磷酸骨架的非特异性相互作用、乳品固有pH缓冲能力改变局部微环境、原料乳内源核酸酶催化适配体降解，以及内源性氧化还原活性物质如抗坏血酸在电极电位下产生背景电流。更重要的是，这四种机制并非独立存在而是协同作用：吸附-传质协同通过蛋白冠形成同时占据识别位点并制造位阻屏障；化学-吸附协同形成恶性循环，阳离子或核酸酶改变适配体构象后暴露疏水碱基增强探针自身非特异性吸附；光学-吸附协同使沉积的蛋白/脂质冠同时散射和吸收光，使信噪比呈乘法式恶化。这些反馈回路解释了单一干预（如简单稀释）在真实乳样中仅获得边际改善的原因。

### 3. 微生物靶标的抗干扰策略

对于食源性病原体等微生物靶标，其微米级尺寸和多表位表面特征使其检测面临独特挑战：致密胶体网络严重限制细菌向传感界面扩散，同时促进靶标细胞和基质蛋白的强非特异性吸附。研究人员总结的策略包括：基于亲和磁分离的高效捕获与隔离，通过适配体功能化磁珠实现靶标细菌从复杂基质中的快速富集和物理分离，直接克服传质阻碍并消除非特异性吸附，但存在非特异性吸附、需外部磁场和批次间变异等局限；抗污染界面工程，如pSBMA两性离子聚合物改性拭子结合纳米酶比色检测单核细胞增生李斯特菌，以及EDTA预处理通过螯合钙离子破坏酪蛋白胶束结构而减少非特异性吸附；针对完整细胞的信号转换与放大，包括滚环扩增、纳米酶催化和光热放大等，其中光电流极性切换策略利用G-四链体/血红素DNAzyme改变电荷转移路径，因常见干扰物通常仅影响光电流强度而不诱导极性反转而具有高特异性；集成化和现场检测平台，包括微流控芯片和基于个人血糖仪的便携式读数系统，其中微流控平台虽实验室性能优异但面临制造成本高、操作复杂和样品通量低等实际应用障碍。

### 4. 生物大分子靶标的抗干扰策略

对于过敏原蛋白和功能性蛋白等生物大分子靶标，其纳米级尺寸、复杂脆弱的三维构象以及与基质中大量非靶标蛋白高度相似的理化性质构成了核心检测挑战。研究人员的策略分类包括：基于构象匹配的高选择性分离富集，利用适配体与靶标蛋白间的精确三维构象互补性，通过适配体亲和固相萃取实现特异性捕获，如pH响应性聚合物修饰磁珠实现乳铁蛋白的高效吸附（233.9 mg·g?1）和温和洗脱，以及在线适配体亲和固相萃取-毛细管电泳-质谱联用技术实现β-乳球蛋白的自动化检测，检测限达0.05 μg·mL?1，较常规CE-MS低200倍；维持活性构象的固定化与界面保护，通过取向固定和可控表面密度保持适配体活性构象，如在聚多巴胺包被磁颗粒上先固定抗污染EK肽再嫁接特异性适配体的层级界面设计，在空间排列上平衡抗污染与靶标识别；构象转变驱动的直接与比率型信号读出，利用适配体与靶标结合时的显著构象变化进行信号转导，包括无标记荧光适配体传感器、DNase I辅助靶标循环放大以及双循环链置换扩增机制，检测限可达4.41 pM。

### 5. 小分子/离子靶标的抗干扰策略

液态乳中小分子和离子危害物（如抗生素、真菌毒素、重金属）通常以痕量水平存在（ppb乃至ppt级），分子量小、缺乏免疫原性、易被基质组分吸附或掩蔽。研究人员建立的策略体系包括：基质净化与超痕量富集的预处理技术，如Carrez试剂澄清法可去除约98%的蛋白质和全部脂肪，适配体功能化金属有机框架磁性分散固相萃取实现五氟喹诺酮类抗生素的同时检测（检测限0.04-0.10 μg·kg?1），以及适配体修饰磁性MIL-101材料富集赭曲霉毒素A达到0.067 ng·L?1的检测限；级联放大与信号转换技术，包括核酸外切酶III辅助循环裂解放大、CRISPR-Cas12a/Cas13a反式切割活性偶联适配体开关，以及磁DNA步行器和三维DNA步行器等DNA纳米机器，检测限可达0.02 fM级别；竞争性和"开关"型传感设计以克服干扰，包括竞争置换模式、荧光共振能量转移（FRET）比率型设计和聚集诱导发光（AIE）探针等，通过内在校正机制（如比率测量）和特定路径设计（如混合信标）有效抵抗复杂基质的化学和物理干扰；基于超高内在灵敏度的直接检测技术与源头探针优化，包括碳纳米管场效应晶体管检测赭曲霉毒素A达0.2 fM的超低检测限，以及将真实乳样引入SELEX反筛步骤获得具有天然基质耐受性的适配体。

## 四、讨论与结论总结

讨论部分指出，尽管过去十年取得了显著进展，但当前研究仍以描述性为主，多聚焦于总结单项研究而非系统批判性比较不同传感策略的优势、局限和适用性；多数研究孤立考察干扰机制，未能考虑真实液态乳基质中多种干扰通路的协同效应；缺乏评价抗干扰性能的标准化定量指标，使跨研究比较困难且不可靠。实际应用方面，复杂操作流程与现场有限的基础设施不兼容，适配体长期稳定性、传感器制造批次间重现性和生产可扩展性仍是商业化关键瓶颈。研究人员提出了四个具体可实施的研究方向：发展真实液态乳基质辅助SELEX技术，在适配体进化过程中引入原料乳、巴氏杀菌乳和UHT乳样本于反筛和正筛循环中，直接筛选对乳蛋白、脂质和内源离子具有固有耐受性的适配体；构建统一标准化抗干扰评价体系，涵盖非特异性吸附、光学屏蔽、传质阻碍和化学干扰四类定量指标，以及检测限倍数变化作为综合评价参数；开发低成本可规模化的防污界面材料，以壳聚糖衍生物和植物多肽链等天然生物质聚合物替代昂贵的两性离子聚合物；集成无泵一次性微流控检测平台，利用离心式和纸基芯片将样品前处理、适配体识别和信号读出整合至单一耗材中。研究结论表明，建立标准化的抗干扰性能评估方案和统一检测基准对于确保研究结果的跨实验室可比性和可重复性至关重要，这些研究方向的推进将加速适配体传感技术从概念验证向实际商业化解决方案的转化，为液态乳安全监测提供可靠高效的技术支撑，并最终促进公共卫生保护。