用于监测贝加尔湖及其他水生生态系统的生物发光酶法检测

《Journal of Great Lakes Research》：Bioluminescent enzymatic assays for monitoring Lake Baikal and other aquatic ecosystems

　　

摘要
生物发光酶法测定是一种用于水生生态系统快速环境监测的有前景工具，它能提供常规基于生物体的生物测试无法捕捉的毒性作用的分子水平信息。本综述总结了基于 NAD(P)H:FMN-氧化还原酶和荧光素酶偶联酶系统的生物发光酶法测定在水生环境质量评估中的原理和应用，主要聚焦于贝加尔湖这一大型湖泊生态系统模型。该分析整合了关于希拉湖的已发表研究以及与水生监测相关的方法学研究，并选取了 2011 年贝加尔湖实地调查中未发表的数据，以说明酶法测定如何应用于检测空间异质性、识别合适的参考水体以及评估自然水体中与氧化还原相关的变异。贝加尔湖被视为主要案例研究，因为其巨大的规模、明显的垂直分层和全球生态意义使其成为评估快速筛查方法在大型湖泊监测中相关性的重要测试系统。希拉湖作为对比的咸水案例被讨论，说明了该方法向化学性质不同的湖泊环境适应的可塑性。本文的原创贡献在于在大型湖泊生态系统监测的统一框架下，对这些先前分散的研究进行了比较综合，并补充了一个明确标识的未发表贝加尔湖数据集作为说明性的方法学案例研究。总体而言，综述证据突出了生物发光酶法测定作为快速筛选工具的潜力，它们补充了传统化学和生物方法，用于监测大型湖泊及其他水生生态系统。

引言
目前，世界上最大的化合物数据库——化学文摘社（CAS）已注册了超过 1.59 亿种物质，其中合成有机物质占相当大比例（https://www.cas.org/cas-data/cas-registry）。此外，每天有新的化学实体被添加到该数据库中。在这种条件下，开发既适用于新合成化合物快速毒性筛查，又适用于监测不同复杂度生物系统状态的分析系统变得至关重要——从单个生物体到整个生态系统。
环境监测通常基于两种主要方法：化学法和生物法。传统上采用环境组分的化学分析，主要通过将污染物浓度与既定的最高允许水平进行比较来评估毒性。这些方法具有卓越的选择性和高分析精度（Hussain and Ke?ili, 2020a, Hussain and Ke?ili, 2020b），这使化学分析长期以来成为环境质量评估的主导方法。然而，一些局限性限制了化学方法在生态监测中的适用性，包括分析时间长、成本高、无法同时识别众多有毒化合物，以及最重要的是缺乏关于生物效应的直接信息（Dopp 等人，2019；Wieczerzak 等人，2016；Xu 等人，2014）。基于效应的监测方法日益被认为是水生生态系统化学分析的必要补充（Dopp 等人，2019）。
此外，由于自然成分、污染物和其他引入物质之间的相互作用，环境对象的化学组成不断变化（Hussain and Ke?ili, 2020a；Dopp 等人，2019）。实践经验表明，即使详细了解了样品的化学组成，也无法可靠地预测其对生物体的毒性作用。而且，常规分析技术并不总是符合绿色化学原则，因为它们通常需要在样品制备过程中使用有毒溶剂（Wieczerzak 等人，2016）。
第二种方法是通过环境对生物体的影响直接评估环境毒性，表现为生物诊断方法。在这种情况下，考察不同组织水平的生物系统对自然和人为因素的响应。生物响应的强度是评估生物群状态及其栖息地质量的基础。根据记录响应的生物组织水平，生物诊断方法通常分为生物标志物分析、生物指示和生物测试。
生物标志物分析通过检测在亚个体和个体水平测量的形态功能参数（生物标志物）的变化，来评估暴露于自然和人为因素的程度（Lima 等人，2018；Sogorb 等人，2014）。生物指示涉及识别可见和/或潜在的损害或偏离正常状况，这些状况作为自由生活生物在其自然环境中压力的指标（Parmar 等人，2016）。生物测试方法能够评估有毒物质或水、土壤和空气分析样品对标准化实验室条件下培养测试生物体生命活动参数的影响（Blaise and Férard, 2005；Bosch-Orea 等人，2017；Ekelund and H?der, 2018）。
目前，生物测试方法在环境立法中受到正式监管并得到广泛实施；然而，与其应用相关的许多问题仍未解决。特别是，已证明生物体对各种有毒物质的敏感性变化很大（Hassan 等人，2016；Parmar 等人，2016）。为了确保毒性评估的可靠性，广泛认为有必要应用一系列测试，采用代表不同营养级的测试生物体（Hassan 等人，2016；Terekhova 等人，2018）。
重要的是，在当前标准化的认证方法中，仍然没有基于在分子水平表现出的效应来评估环境质量的监管方法，例如通过使用酶作为测试对象。这是可以理解的，因为酶不是生物体，因此基于酶的测定代表了对采用整个测试生物体的经典生物测定方法的替代。尽管如此，众多将酶作为环境污染生物标志物的实验研究表明，它们对污染物的作用具有高敏感性和相对特异性（Kratasyuk 等人，2001；Esimbekova 等人，2014；Esimbekova 等人，2021）。事实上，在污染物暴露下生物体观察到的生命功能紊乱，主要是由酶活性和酶系统中断导致的代谢改变驱动的（Sogorb 等人，2014）。
积累的证据清楚地表明了酶法测试在环境监测中的前景，其中酶作为污染的指示器，概念上类似于基于生物标志物的方法（Esimbekova 等人，2014；Esimbekova 等人，2021；Sogorb 等人，2014），但被直接用作测试对象。因此，酶法测试的原则在很大程度上对应于使用生物测试方法进行生态毒理学评估的原则。使用酶作为测试对象可以简化和加速分析程序，并通过用定义明确的试剂替代整个生物体来改善重复性和再现性。
从这个角度来看，酶法测试可以被视为环境监测中的一个独立方向，结合了生物诊断作为评估生物效应工具的优势以及化学分析（依赖试剂而非生物体）的优势。
大型湖泊生态系统由于明显的空间异质性、垂直分层、长水体滞留时间以及高度的生态和社会经济价值，为监测提出了特别苛刻的背景。这些特征在贝加尔湖中尤为明显，它是地球上最深的湖泊，体积最大的天然淡水水库，也是全球最重要的内陆水体之一（Brown 等人，2021）。在这样的系统中，能够帮助区分水质量自然变异性与潜在危险变化的快速筛选工具具有重要的实际意义。长期观察表明，贝加尔湖已经经历了与变暖相关的大量物理和生物变化，而最近的研究记录了其滨岸带的营养状态变异和富营养化相关过程（Bondarenko 等人，2022；Domysheva 等人，2023；Hampton 等人，2008；Izmest'eva 等人，2016；Timoshkin 等人，2014, Timoshkin 等人，2016）。
尽管对基于酶的生物测定方法兴趣日益增长，但它们在大型湖泊生态系统监测中的作用仍未得到充分的系统化。现有文献包括方法学研究、案例报告和专门针对特定水生环境的出版物，但生物发光酶法测定对大型湖泊监测的相关性尚未在单一综述框架下得到综合。这一差距很重要，因为最近关于基于效应的监测和水生生态毒理学测试的综述强调，生物测定最具有信息量是在嵌入更广泛的监测框架中时，而不是作为孤立的方法学演示使用（Brack 等人，2016；De Baat 等人，2019；Schuijt 等人，2021）。
因此，本综述旨在总结生物发光酶法测定的原理和分析特征，并评估它们在监测大型湖泊生态系统中的适用性，以贝加尔湖作为主要案例研究，以希拉湖作为对比的咸水示例。本综述的原创贡献在于将已发表的证据与选定的来自 2011 年贝加尔湖实地调查的未发表观察结果整合到统一讨论中，重点关注空间异质性、参考水选择、现场适用性以及酶法测定在补充常规监测方法中的作用。

章节片段
综述的范围和方法
本综述综合的大量材料源于同一研究小组和合作者的先前已发表研究，包括在希拉湖的应用（Kratasyuk 等人，1999；Vetrova 等人，2002），更广泛的水生环境（Kratasyuk 等人，2001），以及基于酶的生物发光测试的方法学发展（Esimbekova 等人，2009, Esimbekova 等人，2013, Esimbekova 等人，2014, Esimbekova 等人，2015, Esimbekova 等人，2021）。在

生物发光酶法测定在环境监测中的原理
1987 年，提出了生物发光酶法生物测试的概念（Kratasyuk and Gitelzon, 1987）。该概念基于使用源自发光细菌的酶 - 底物系统作为测试对象，而不是整个生物体，来评估水、土壤和空气的毒性和环境污染。该方法依赖于通过测试物质和混合物对发光细菌发光酶反应的影响来检测其毒性特性发光

淡水湖的生物发光酶法测试：贝加尔湖
贝加尔湖是位于西伯利亚东南部南部区域的构造湖，表面积为 31,722 平方公里。它是地球上最深的湖泊，体积最大的天然淡水水库，也是欧亚大陆表面积最大的淡水湖。关于贝加尔湖地理位置、水文学、生物多样性和环境意义的详细信息见 Kozhov, 1963, Kozhov, 1972 的经典专著，贝加尔湖图集（Galaziy, 1993），以及更多

咸水湖的生物发光酶法测试：作为对比案例的希拉湖
希拉湖（俄罗斯哈卡斯）被纳入本综述并非严格意义上的大型湖泊，而是作为对比案例研究，说明生物发光酶法测定如何适应咸水和氧化还原结构化的水生环境。这种比较是有用的，因为旨在用于大型湖泊监测的方法理想情况下应在一系列物理化学条件下保持稳健。
希拉湖（俄罗斯哈卡斯）是一个异层水体（长度：9.3 公里；宽度：5.3 公里；表面积：生物发光酶法测定对大型湖泊监测的相关性
综述证据表明，生物发光酶法测定在大型湖泊研究中可能特别有用，作为快速筛选工具，而不是作为化学分析或基于生物体的生物测试的独立替代品。这一区别很重要。大型湖泊监测通常涉及广泛的实地调查、多个深度层和重复的季节性采样，所有这些都会产生大量需要优先排序的样品（Dopp 等人，2019；Hassan 等人，2016

局限性与未来方向
本综述所考虑证据的几个局限性应予以承认。首先，第 4 节包括 2011 年进行的贝加尔湖实地调查中选定的未发表观察结果，而其余环境证据主要源自已发表研究。因此，贝加尔湖数据集被呈现为说明性的方法学案例研究，而不是对该湖泊的最新环境诊断。鉴于持续的人为压力

结论
基于 NAD(P)H:FMN-氧化还原酶和荧光素酶偶联酶系统的生物发光酶法测定代表了对水生生态系统监测的一种有前景的方法学补充。综述研究表明，该方法对与空间异质性、深度相关差异和氧化还原结构相关的水性质变化具有敏感性。
在此背景下，贝加尔湖尤为重要，因为其规模、分层和全球生态

CRediT 作者贡献声明
Valentina A. Kratasyuk: 监督，方法论，经费获取，概念化。Elena N. Esimbekova: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，方法论，调查，概念化。Albert M. Oyun: 写作 – 初稿。Elizaveta M. Kolosova: 写作 – 初稿，可视化。Oleg S. Sutormin: 写作 – 初稿。Elena V.

Vetrova：撰写——初稿、调查研究

利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

基金资助
本研究由俄罗斯联邦科学与高等教育部的国家任务资助（项目编号：FWES-2024-0018）。

Valentina A. Kratasyuk | Elena N. Esimbekova | Albert M. Oyun | Elizaveta M. Kolosova | Oleg S. Sutormin | Elena V. Vetrova

西伯利亚联邦大学，俄罗斯联邦克拉斯诺亚尔斯克市斯沃博德尼大道79号，邮编660041