环境现实微塑料混合物对地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)分子机制与细胞效应的综合评估

《Journal of Hazardous Materials》：An integrated approach to assess the molecular mechanisms and cellular effects of environmentally realistic mixtures of microplastics in Mytilus galloprovincialis

　　

研究人员采用综合方法评估了环境现实微塑料(microplastics, MPs)混合物在地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)中诱导的分子机制和细胞效应。研究人员将贻贝暴露于环境来源的MPs与原始(virgin) MPs混合物中，发现环境MPs比原始MPs诱发更强的生物效应，并观察到邻苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)生物累积的增强。环境MPs主要靶向免疫、抗氧化、代谢途径及微生物群落，而证据权重(Weight of Evidence, WoE)框架为MPs混合物的危害评估提供了稳健支撑。

近年来，海洋塑料污染已成为全球性环境挑战。微塑料(microplastics, MPs，粒径<5 mm)由于其在海洋环境中的普遍存在和数量优势，对生态系统和公众健康构成显著威胁。MPs是一类异质性污染物，其聚合物类型、尺寸、形状以及所含添加剂（如增塑剂、阻燃剂等）各不相同，这些特性共同决定其环境归趋和生物效应。然而，以往毒理学研究多集中于原始单聚合物MPs，忽视了环境真实场景中MPs的复杂化学负载和风化状态，导致对实际风险的评估可能存在偏差。为弥补这一知识空白，研究人员在《Journal of Hazardous Materials》发表了一项综合研究，以地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)为模型，比较了环境来源MPs与原始MPs的毒理学效应。

研究人员设计了三种MPs暴露场景：环境塑料混合物(Environmental Plastic Mixture, EPM)，由亚得里亚海、利古里亚海和比斯开湾沿岸收集的硬塑料制品微粉化制备，含聚乙烯(PE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)和聚氯乙烯(PVC)五种聚合物，相对丰度为43%、32.4%、23.1%、1.12%和0.38%；原始塑料混合物(Virgin Plastic Mixture, VPM)，由商业原始颗粒按相同比例混合；以及“Rapido”拖网橡胶(Rapido Trawling Rubber, RTR)，由亚得里亚海捕捞作业用的橡胶护套微粉化制备，主要成分为三元乙丙橡胶(EPDM)并含有增强纤维。所有MPs粒径均为20–50 μm，暴露浓度1000 items/L，持续14天。贻贝样本于2023年10月采自亚得里亚海中部的贝类养殖场（壳长4.6±0.5 cm，性别未鉴定）。

主要技术方法包括：利用中红外光谱（UATR-FTIR和μATR-FTIR）确认聚合物组成与形态；采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定全软组织中11种邻苯二甲酸酯(PAEs)的生物累积；使用标准化生物标志物方法检测细胞免疫参数（粒细胞/透明细胞比例、吞噬率、溶酶体膜稳定性）、遗传毒性（DNA链断裂）、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性、抗氧化酶（CAT、GPx、GST）、总氧自由基清除能力(TOSC)以及脂质代谢指标；通过RNA测序(RNA-seq)和16S rRNA扩增子测序分别表征转录组和微生物群落结构；最终采用证据权重(Weight of Evidence, WoE)方法，将不同证据线(Lines of Evidence, LoE)整合为危害等级。

研究结果如下：

**3.1 邻苯二甲酸酯生物累积**
EPM暴露组贻贝全软组织中的PAEs总浓度（8286±880 ng/g干重）显著高于对照组（1810±791 ng/g），其中DEHP占90%以上；VPM和RTR组PAEs水平虽高于对照但无统计学差异。该结果表明，环境来源的MPs能有效释放并转移塑料添加剂，尤其是DEHP，可能与风化引起的表面性质改变有关。

**3.2 生化与细胞分析**
EPM和RTR暴露显著降低了粒细胞/透明细胞比例和吞噬率，EPM还降低了溶酶体膜稳定性；所有MPs处理均显著增加DNA损伤。AChE活性在EPM组的血淋巴和鳃中显著升高，RTR仅在血淋巴中升高。鳃组织中，EPM和RTR诱导总GPx和GST活性升高；消化腺中RTR显著提高GST活性，且RTR使TOSC对ROO•、HO•和ONOO-均显著增加，EPM使TOSC对HO•增加。EPM还抑制了酰基辅酶A氧化酶(ACOX)活性，并增加中性脂质和脂褐素含量。主成分分析显示CTL与所有MPs处理分离，EPM和RTR聚在一起，与VPM和CTL区分明显，提示环境来源MPs具有更强的生物学效应。

**3.3 基因表达谱**
转录组分析显示，不同MPs处理在两个组织中的差异表达基因(DEGs)数量和通路富集不同。EPM在消化腺中引起凋亡和免疫相关基因（如BIRC3、BCL2、IFI44L）的调控，并下调抗氧化、溶酶体及线粒体代谢基因；在鳃中上调凋亡相关基因（CASP2等）和“应激激活MAPK级联”通路。VPM在消化腺中富集内体分选和免疫反应相关基因，在鳃中上调Toll样受体(TLRs)和NF-κB信号通路。RTR在消化腺中上调热休克蛋白（HSP90AA1等）和泛素-蛋白酶体成分，在鳃中富集MAPK、自噬、mTOR及免疫相关通路。三种处理存在共同基因变化，如GSTO2和cathepsin下调、PLIN2上调。

**3.4 微生物群落特征**
16S rRNA分析表明，消化腺和鳃的细菌群落存在显著组织差异。EPM暴露导致鳃中α多样性增加，并在消化腺中显著富集了Tenacibaculum属，而VPM和RTR处理引起的变化较少。这一结果提示环境来源MPs可能特异性影响宿主相关微生物群落，尤其是消化腺。

**3.5 加权整合**
通过WoE方法整合PAEs生物累积、转录组和生物标志物三个证据线，EPM在生物累积证据线被评为“MAJOR”，VPM和RTR为“SLIGHT”；所有处理的转录组证据线均为“MODERATE”；生物标志物证据线中EPM和RTR为“MODERATE”，VPM为“SLIGHT”。最终综合分类为EPM和RTR“MODERATE”，VPM“SLIGHT”，表明环境来源MPs的综合危害高于原始MPs。

讨论部分指出，环境来源MPs（尤其是EPM）的高PAEs累积可能与风化导致的表面理化性质改变及污染物吸附有关。DEHP作为优势单体，其内分泌干扰和免疫毒性已在多种水生物种中报道。免疫功能的抑制（如吞噬率降低、溶酶体不稳定）与转录组中免疫相关基因的调控一致，AChE活性的升高可能涉及神经-内分泌-免疫网络的代偿调节。氧化和代谢响应呈组织特异性：鳃主要激活酶促抗氧化防御，而消化腺则以非酶抗氧化和能量代谢重编程为主；MAPK、mTOR和自噬信号通路的激活构成一个相互关联的应激网络。微生物群改变（如Tenacibaculum富集）与免疫损伤相关，但因果尚不明确。加权整合结果支持环境来源MPs污染物的更高毒理学关切。

研究结论（翻译自原文）：本研究结合化学、分子、细胞和微生物群分析，在多层次框架内对地中海贻贝暴露于环境来源微塑料材料引起的生物效应进行了综合评估。暴露于野外收集硬质塑料制成的微塑料（EPM）导致塑料添加剂（尤其DEHP）的显著累积，并伴有氧化、免疫相关及代谢改变；而橡胶来源的微塑料（RTR）主要影响鳃中的氧化还原平衡和能量代谢。相比之下，组成匹配的原始微塑料混合物（VPM）产生的生物反应较有限，大部分改变发生在分子层面。研究还揭示了组织特异性反应模式：鳃作为主要防御屏障，消化腺则参与代偿性代谢调整。EPM和RTR的更强效应得到了跨组织的转录组、生化和细胞学指标的一致支持，并通过证据权重定量整合为更明显的综合毒理学特征。这些发现仅适用于当前研究的特定条件，不能一概而论，因为环境老化的影响随风化条件及材料特性而变化。未来需要结合颗粒摄取定量、全面颗粒表征以及全颗粒与无颗粒渗滤液暴露的实验，进一步阐明机制。然而，本研究证明，野外来源的材料能引发原始模型MPs无法充分反映的毒理学特征，支持将环境现实材料纳入微塑料危害评估框架。