聚苯乙烯的酶促生物转化：铜绿假单胞菌丝氨酸水解酶的界面氧化修饰

《Journal of Hazardous Materials》：Enzymatic Biotransformation of Polystyrene: Interfacial Oxidative Modification by a Serine Hydrolase from Pseudomonas aeruginosa

　　

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  一种新型丝氨酸水解酶促进聚苯乙烯（PS）表面的界面氧化修饰。
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  SH介导的表面氧化作用无需广泛的聚合物解聚即可发生。
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  AEBSF抑制作用表明SH活性参与了PS表面的修饰过程。
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  GC–MS检测到SH处理后疑似氧化芳香族产物。
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  酶介导的界面转化揭示了PS老化的潜在途径。

章节摘要

引言

塑料对现代社会至关重要，但其在环境中的持久性和耐久性带来了日益严峻的全球环境挑战。PS是产量最大的合成聚合物之一，全球年产量超过2500万吨[1]。与聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）和聚氯乙烯（PVC）一同，PS在很大程度上导致了陆地和海洋环境中持久性塑料废弃物的积累[2]、[3]、[4]。尽管全球

丝氨酸水解酶的克隆

候选SH基因（位点标记PA50071_RS20130；NCBI RefSeq蛋白登录号：WP_079380720.1）在我们的前期研究中[43]已被鉴定。其编码序列通过基因特异性引物（正向引物：5′-CGCCAGTTGCTCTGCCATCG-3′；反向引物：5′-TGCCATGTGGGCGACGCGGC-3′）从铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组DNA中扩增。PCR产物经酶切和连接后，被插入pET-28b(+)表达载体（Novagen，美国威斯康星州麦迪逊市）中，以编码用于亲和纯化的N端His?标签。所得

重组SH蛋白的表达与纯化

经确认的pET-28b–SH表达质粒被转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3)中以生产重组蛋白。转化细胞在含有50?μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中，于37°C振荡培养至600?nm波长处的光密度（OD???）达到0.6–0.8。通过加入IPTG使终浓度达到1?mM以诱导蛋白表达，随后在20°C下以200?rpm振荡培养16?小时。通过离心在5,600?rpm下收集细胞15 min。

圆二色谱（CD）光谱

使用JASCO J-1500圆二色光谱仪（Jasco Corporation，日本）记录远紫外圆二色谱（CD）光谱。将纯化的SH酶配制成1× PBS（pH 7.0）中浓度为200?μg/mL的溶液，并在1 mm光程石英比色皿中测量。在190–260?nm波长范围内采集CD光谱。为评估热稳定性，在25°C至95°C范围内进行温度依赖性CD测量，并监测222?nm处的CD信号以确定热变性

酶动力学

初始反应速率（v?）从时间依赖性吸光度变化的线性区域测定，对应于底物转化率小于10%的情况，使用酶标仪进行测定。酶活性测定使用对硝基苯酚底物（对硝基苯酚乙酸酯[pNPA]和对硝基苯酚辛酸酯[pNP-C8]）及芳香族底物（苯乙烯、1,2-二氢萘[1,2-DHN]和1-甲氧基萘[1-MeO-Nap]），底物浓度范围为0.1至10.0?mM。反应

PS膜与纯化的SH酶孵育后的表征

将聚苯乙烯（PS）膜（1.0 cm × 3.0 cm；约15 mg）与纯化的丝氨酸水解酶（SH；2 μM）在5 mL 50 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）中，于40 °C以150 rpm振荡孵育最长30天。所有孵育均在无痕量金属缓冲液中、避光条件下进行，以最大限度减少非生物干扰。孵育结束后，用2%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤膜4 h，用超纯水冲洗三至四次，然后在烘箱中以

场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）分析

使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM; SU8230, Hitachi, 日本东京)检查PS膜的表面形貌。成像前，将PS膜固定在铜带上，并使用离子溅射仪（E-1045, Hitachi High-Technologies Corporation, 日本东京）以5 mA的电流溅射镀覆一层薄铂层15 s，以增强表面导电性。SEM成像的加速电压为3.0 kV。

能量色散X射线光谱（EDS）分析

能量色散X射线光谱（EDS），与场发射扫描电子显微镜（FE-SEM; X-Max 150, Oxford Instruments, 英国牛津）联用，用于评估SH处理后PS膜元素组成的变化。元素分析在3.0 kV的加速电压下进行，氧含量以重量百分比（wt%）定量。每个实验条件均独立分析三片PS膜（n = 3），结果

傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析

采用溴化钾（KBr）压片法，通过FTIR分析PS膜的表面化学修饰。将PS膜（约0.5 mg/mL）溶于四氢呋喃（THF）中25 °C下溶解5 min，然后在氮气下蒸发溶剂1 h。将样品（1–2 mg）与100 mg KBr研磨混合，并使用数字液压压片机（CrushIR, Pike Technologies, 美国威斯康星州）在6 MPa压力下压制1 min制成13 mm压片。在Nicolet 6700光谱仪（Thermo Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上记录光谱。

X射线光电子能谱（XPS）分析

使用X射线光电子能谱（XPS; ESCALAB 250Xi, Thermo Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）分析PS膜表面的元素组成。将SH处理的膜切成1.0 cm × 1.0 cm的小片并固定在导电碳带上进行测量。C1s的XPS光谱在276–300 eV结合能范围内采集，O1s的XPS光谱在526–540 eV结合能范围内采集。每个处理条件下的测量均重复三次（n = 3），并展示了代表性光谱。

结果与讨论

聚苯乙烯（PS）的酶促转化仍面临挑战，因其具有疏水性和化学惰性的碳-碳骨架[15]、[54]、[55]。基于我们此前发现从Z. atratus肠道中分离的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）通过SH介导体内PS转化的结果（图1A），本研究旨在评估幼虫来源的铜绿假单胞菌衍生SH酶诱导PS表面早期修饰的能力。铜绿假单胞菌来源的SH基因被克隆至

研究局限性与未来展望

尽管本研究提供了SH介导的界面PS修饰的多学科证据，但关于其潜在分子机制和环境相关性仍存在一些局限性。由于典型的丝氨酸水解酶缺乏内建的电子传递系统，仅靠水进行的无辅因子烃类氧化和C–H键活化在机制上仍不明确，尚需验证来自外部氧化剂、活性氧物种或电子受体的输入。此外，推测的

结论

本研究确立了一条此前鲜有研究的酶介导途径，用于化学惰性的PS的早期转化，通过鉴定和表征一种从取食PS的黑水虻（Zophobas atratus）肠道微生物组中分离的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中获得的新型丝氨酸水解酶（SH）。与传统的整体解聚系统不同，SH与一种独特的界面生物转化相关联，其特征是渐进的表面氧化、局部形貌变化以及

环境意义

本研究建立了丝氨酸水解酶活性与PS早期化学老化之间的联系，突出了微生物酶在持久性塑料环境转化中可能发挥的作用。SH介导的表面氧化和形貌变化表明，聚合物-水界面是化学修饰的重要位点，可能影响表面极性、反应活性以及后续风化的敏感性。此外，GC–MS分析

作者贡献声明（CRediT）

苏东银（Dong-Eun Suh）：验证、研究。李成宇（Sukkyoo Lee）：写作 – 审阅与编辑、验证、项目管理、方法论、研究、经费获取、形式分析、概念构思。金洪来（Hong Rae Kim）：验证、研究。成柄贤（Bong Hyun Sung）：验证、研究。Indra Nyamjav：写作 – 原稿、可视化、研究、形式分析、概念构思。李恩京（Lee Eunkyo）：可视化、研究、形式分析。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文所报道的工作。

致谢

本研究得到韩国大邱广域市科学技术研究院（DGIST）研发计划（科学技术信息通信部，大韩民国，编号21-BRP-04和22-BRP-04）的支持。感谢大邱广域市科学技术研究院核心研究设施中心（CCRF）的朴芝允、赵秀珍和金基熙提供技术支持。作者衷心感谢大邱广域市科学技术研究院蛋白生物物理学实验室的Janbolat Ashim和俞茂勋提供圆二色谱（CD）光谱设施使用权及技术支持。

利益冲突

作者声明他们

Indra Nyamjav|EunKyo Lee|Hong Rae Kim|Bong Hyun Sung|Dong-Eun Suh|Sukkyoo Lee