Period3转基因小鼠通过下调Trpm7表达减轻镉诱导的慢性肾毒性

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Period3 transgenic mice attenuate cadmium-induced chronic renal toxicity associated with reduced Trpm7 expression

　　

镉（Cd）是一种可通过环境和职业暴露进入人体的重金属，具有环境持久性和长期生物蓄积性。研究人员发现，镉暴露可通过抑制Period3（Per3）扰乱肾脏昼夜节律调控，从而增加肾毒性易感性。体内和体外研究均表明，Period3过表达可减轻镉诱导的肾毒性。其保护机制与下调瞬时受体电位melastatin 7（Trpm7）表达、减少镉在肾脏的蓄积以及缓解氧化应激相关的肾小管损伤和凋亡有关。这些结果提示，昼夜节律调控可影响机体对重金属毒性的易感性，靶向昼夜节律通路可能为减轻镉毒性效应和改善健康风险评估提供新策略。

一、研究背景

镉（Cd）是一种具有环境持久性和10–30年人体生物学半衰期的有毒重金属，可通过污染食物、饮水、职业暴露及吸烟等途径进入人体。日本富山县神通川流域曾流行的“痛痛病”即为慢性镉中毒所致，患者肾脏中镉浓度极高。既往研究已表明，慢性镉暴露主要通过诱导氧化应激和炎症反应造成肾损伤，镉可与细胞膜作用并产生过量活性氧，导致线粒体功能障碍，同时抑制谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等抗氧化分子活性。虽然一些化合物如taxifolin、α-硫辛酸和蜂王浆可在啮齿动物中减轻镉诱导的肾毒性，但镉吸收与排泄相关机制尚未被充分研究，特别是昼夜节律基因是否参与肾脏镉蓄积仍不清楚。已有研究发现核心时钟基因与肾脏疾病密切相关，如脑和肌肉芳香烃受体核转运蛋白类似蛋白1（BMAL1）缺失可导致小鼠肾功能异常，隐花色素1/2缺失可升高血浆醛固酮水平；同时，BMAL1可通过E-box元件直接调控TRPM7基因转录。然而，镉诱导的慢性肾损伤与时钟基因调控之间的关联仍不明确。

二、研究内容与主要结论

研究人员将5周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分组，以100 ppm氯化镉饮水暴露1、3或6个月，观察发现肾脏镉蓄积随时间渐进增加，6个月时血浆血尿素氮（BUN）显著升高，肾脏出现轻度近端小管损伤，TUNEL阳性凋亡细胞增加，丙二醛（MDA）水平升高，肾损伤分子-1（KIM-1）和中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）以及cleaved CASPASE-3表达上调。在检测的核心时钟基因中，Per3基因表达于镉暴露3个月后出现持续下降。基于此，研究人员构建了FLAG-mPer3过表达转基因（TG）小鼠（A9系），发现Per3过表达可减轻镉诱导的肾功能障碍、肾小管损伤、氧化应激和细胞凋亡，并降低肾脏镉蓄积。在检测的八个与镉转运相关的基因中，只有Trpm7表达在镉暴露TG小鼠中显著下调。体外使用小鼠肾近端小管样MuRTE61细胞进一步证实，Per3过表达可减轻镉诱导的细胞毒性，抑制cleaved CASPASE-3表达，降低细胞内镉含量并下调Trpm7；而小干扰RNA（siRNA）敲低Trpm7同样可减少细胞内镉蓄积。结论表明，Per3通过下调Trpm7表达减少肾脏镉蓄积，从而减轻镉诱导的慢性肾毒性。

三、主要关键技术与方法

本研究使用了3周龄雌性C57BL/6J小鼠（购自CLEA Japan）以及Per3转基因（TG）小鼠和非转基因野生型（TW）小鼠，饲养于12小时光照/12小时黑暗循环条件下，以100 ppm氯化镉饮水建立慢性镉暴露模型。体外实验使用来源于p53敲除小鼠的肾近端小管样MuRTE61细胞（由日本北里大学Sasaki博士惠赠）。主要技术包括：苏木精-伊红（H&E）染色进行组织病理学评估，TUNEL染色检测凋亡，比色法测定肾脏MDA，血浆BUN测定，电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定肾组织和细胞镉含量，Western blot检测KIM-1、NGAL、cleaved CASPASE-3蛋白水平，实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测时钟基因和镉转运体mRNA表达，alamarBlue法检测细胞活力，以及质粒过表达和siRNA敲低实验。

四、研究结果

4.1 镉暴露对体重和肾功能标志物的影响

在26周镉暴露期间，小鼠体重、饮水量和进食量均无明显变化。肾脏镉蓄积从1个月起逐步增加，6个月时显著升高。镉暴露6个月后，血浆BUN水平显著上升，H&E染色显示肾近端小管上皮细胞轻度变性，TUNEL阳性细胞增多，肾MDA含量显著升高，Kim-1和Ngal的mRNA及蛋白表达均上调，cleaved CASPASE-3蛋白水平也升高；但促炎细胞因子Tnfα和Il-6的mRNA表达无明显变化。

4.2 镉对肾脏时钟基因表达的影响

镉暴露1、3、6个月后，Bmal1、Clock、Cry1和Per1的表达未被镉改变，但存在年龄相关波动。Per2在镉暴露1个月时显著下调，但这一差异在6个月时不再显著。在所有检测的时钟基因中，Per3从3个月起显著下降并持续至6个月，表现出最持久的抑制。

4.3 Per3过表达转基因小鼠的构建与鉴定

研究人员构建了pCAG-FLAG-mPer3表达质粒，并通过原核显微注射获得F0代15只小鼠，其中4只阳性，并建立A2、A4、A9三个独立品系。A9系肾脏Per3表达显著高于TW小鼠，因此用于后续实验。免疫荧光显示FLAG与近端小管标志物LTL共定位，说明Per3主要在近端小管细胞中过表达。在ZT2至ZT22的多个时间点中，TG小鼠Per3表达持续高于TW小鼠，且昼夜节律波动幅度变小。TG小鼠Bmal1表达在ZT10、ZT18和ZT22显著升高，而Per1、Per2、Clock和Cry1无显著差异。

4.4 Per3对小鼠镉诱导肾毒性的影响

在6个月镉暴露后，TW小鼠血浆BUN显著升高，而TG小鼠未见显著升高。TG小鼠肾脏组织病理损伤减轻，TUNEL阳性细胞减少，肾MDA水平显著降低，Kim-1和Ngal的mRNA及蛋白表达低于镉暴露TW小鼠，cleaved CASPASE-3蛋白表达也降低。结果表明Per3过表达可减轻镉诱导的慢性肾毒性。

4.5 Per3对镉排泄相关转运体的影响

镉暴露后，TG小鼠肾脏镉蓄积显著低于TW小鼠。在Dmt1、MgT1、Trpm6、Trpv5、Trpv6、Zip8、Zip14和Trpm7八个镉转运相关基因中，其余七个基因在各组间没有差异，只有Trpm7表达在镉暴露TG小鼠中显著低于镉暴露TW小鼠，且未处理TG小鼠也呈现下降趋势。提示Trpm7下调可能与TG小鼠肾脏镉蓄积减少有关。

4.6 Per3对MuRTE61细胞镉蓄积和Trpm7表达的影响

镉处理以浓度依赖方式降低MuRTE61细胞活力。2 μM镉处理24小时可显著下调Per2和Per3表达，与体内结果一致。Per3过表达可显著缓解镉诱导的细胞活力下降，并抑制cleaved CASPASE-3表达，而Per2过表达无此保护作用。Per3过表达还可降低细胞内镉含量，并显著下调Trpm7表达，而其他转运体基因无明显变化。Trpm7敲低同样可降低细胞内镉蓄积，进一步支持Trpm7参与镉摄取。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次证明Per3在镉诱导肾毒性中的保护作用。镉暴露后肾脏氧化应激、近端小管损伤和凋亡增加，而Per3过表达可显著减弱这些改变。尽管Per1和Per2已被报道参与组织损伤和应激反应，但本研究显示Per2过表达在镉诱导的细胞毒性中没有保护作用，提示Per3在PER家族中具有相对独特的生物学功能。Per3过表达还伴随Bmal1表达升高，提示昼夜节律转录网络可能参与Trpm7的调控，但Per3、Bmal1和Trpm7之间的精确分子机制仍需进一步研究。研究也存在局限，包括CAG启动子导致Per3在多个组织非特异性过表达、转基因插入位点可能影响表型、TG小鼠体重偏低，以及100 ppm镉暴露浓度