纳米壳内部：评估亲脂性左氧氟沙星在眼用纳米载体中包封率的光谱与色谱方法

《Journal of the Indian Chemical Society》：Inside the Nano-shell: Spectrometric and Chromatographic Approaches to Assess Encapsulation Efficiency of Lipophilic Levofloxacin in Ocular Nanocarriers

　　

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  一种新颖的纳米分析方法，旨在准确计算制备和表征的SLNs中LVE的百分包封率。
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  已开发、验证并尝试了四种非典型分析方法，用于测定SLNs非水相中亲脂性LVE的含量。
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  分光光度法、荧光法和HPLC-ELSD技术的结果进行了统计学比较，差异不显著，同时，后者可同时筛选LVE与疏水性成分。

引言

纳米制剂是实现药物控释、靶向给药和个性化医疗的机械前体。基于纳米技术的药物递送系统可以是肠外给药、口服、眼部给药或甚至局部外用。它们在结构、功能甚至可负担性方面正经历着指数级增长。纳米制剂药物的吸收和生物利用度增强；无论是亲水性还是疏水性药物，均可在具有良好生物相容性、最小生物毒性和易于规模化的条件下充分实现^{1, 2, 3, 4, 5}。百分包封率（%EE）是实验室制备的固体脂质纳米颗粒（SLNs）的主要计算表征参数。制剂在SLNs中的治疗剂的%EE，是纳米颗粒中收集的药物量与制备整个制剂时加入的初始量之比。直接或间接方法用于测量包封率；作为指示药物负载的数值^[6]。然而，所应用的分析过程，包括程序、技术和方法，代表了研究人员评估其提出的纳米制剂并准确评估其负载能力的主要挑战。

本研究描述了根据已报道的技术^[2]，在略微修改的情况下，制备用于眼部抗微生物用途的左氧氟沙星（LVE）SLNs。完成并展示了改良SLNs的更新表征。直接对脂质相进行测定，以测定LVE的含量，同时存在其他无活性成分。本研究涉及四种不同的分析程序，使用三种不同的分析技术：分光光度法（λ_max和第一导数）、光谱荧光法和采用蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱（HPLC）。每种方法都旨在直接评估负载LVE的SLNs的%EE。后者程序定义为测定SLNs脂质相中包封的活性成分；即在固体脂质（甘油酯、脂肪酸、蜡等）、乳化剂和纳米制剂中的任何其他无活性成分存在的情况下，选择性地测定药物含量；所有这些都呈现在单一色谱图中。

左氧氟沙星半水合物（LVE）的化学名称为(-)-(S)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶[1,2-1,4]苯并噁嗪-6-羧酸半水合物。其化学结构如图1所示。其分子式为C₁₈H₂₀FN₃O₄ · ?H₂O，分子量为370.4 g/mol。LVE为淡黄白色至黄色白色晶体或结晶性粉末。微溶于水、丙酮和甲醇；溶于乙酸和二甲基亚砜；几乎不溶于甘油和正辛醇^[7]。LVE是美国药典USP 46^[8]和英国药典BP 2022^[9]中的法定药物，其中LVE，无论是纯品还是药学剂量形式，均通过液相色谱-二极管阵列检测进行测定。

根据文献报道，为了测定包封效率和负载能力，负载LVE的纳米颗粒通过间接测定，即在水相中进行测定，经多步离心和过滤程序后^{10, 11, 12}。游离未负载或未捕获的LVE通过290 nm处的紫外分光光度测定或在360 nm处采用HPLC-UV检测进行定量。实际药物容量通过差值计算得出。相反，本研究是对LVE在亲脂相即SLNs本身进行直接测定。最近，LVE已涉及光学原位比色和荧光传感以及智能手机即时探针^{13, 14}。LVE采用UV检测在眼科溶液中^[15]和基于纤维素的水凝胶薄膜中进行色谱定量，用于药物控释^[16]，以及ELSD检测^[17]等报告。其他喹诺酮类药物的相关研究也已被报道。

已开发出灵敏、专一且快速的分光光度法、光谱荧光法和采用蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱法，用于测定原药和纳米制剂中LVE的含量，以确定百分包封率。分光光度法的可用性、简便性和低成本是开发两种分光光度法测定原药和负载LVE的SLNs制剂中LVE含量的基础。方法I依赖于在LVE的λ_max 292 nm处直接测量吸光度，而方法II依赖于在284-305 nm处测量第一导数峰-峰值振幅。导数分光光度法是定量分析中的广泛应用，也是最简单的方法之一，通过去除无关的光谱干扰来提高选择性。

第三种方法是光谱荧光法，依赖于使用294 nm的激发波长直接监测在486 nm处发射的本征荧光强度，以获得最高灵敏度。此外，第四种方法为HPLC-ELSD，在选定的色谱条件下，提供了SLNs活性成分在高浓度安慰剂基质成分存在下的高效分离，以筛选整个纳米制剂的成分。LVE的峰在1.61 ± 0.01 min处以良好的分辨率出现。LVE和惰性脂质成分的整体色谱运行在不到6分钟内完成了良好的分离，实现了完整筛选。

实验室制备的SLNs以及对照样品同时进行离心，以完全分离脂质相和水相。负载LVE的SLNs制剂中亲脂性LVE的百分包封率，通过对脂质相直接应用所建议的四种分析方法与已报道的色谱方法进行比较来估算。本研究的目标已通过所有方法结果百分值的统计学比较得以实现。此外，所引用的研究是首次尝试分析方法直接穿透纳米颗粒的脂质相，在水不溶性相邻物质中评估亲脂性API，代表了纳米制剂分析的挑战。

章节摘要

材料

左氧氟沙星半水合物（纯度98.92%）购自Pharco Pharma公司。硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十六烷基三甲基溴化铵和冰醋酸购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。Tween 80购自Alpha Chemika（印度）。氯仿和甲醇（HPLC级）购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国）。所有其他所用溶剂和材料均为分析纯级。

仪器

所有分光光度测量均使用双光束UV-1800进行

结果与讨论

在本研究中，SLNs制剂按"材料与方法"部分所述方法制备。在用于制备SLNs的脂质中，硬脂酸具有高度结晶性的脂质结构。这种多晶形态阻碍药物从SLN核心迁移到表面及混合物基质。因此，为降低脂质相的结晶度并提高负载能力，在脂质相中添加单硬脂酸甘油酯（GMS）作为共表面活性剂，以稳定SLNs结构并增强LVE

方法开发

所提出的方法在选定的色谱条件下，实现了活性成分在安慰剂成分存在下的选择性测定。在制剂中各种成分之间实现了更好的峰形和良好分离。与对照混悬液相比，LVE的峰在约1.61±0.02 min处以良好分辨率出现。图6显示了对照混悬液（安慰剂）和SLNs制剂的色谱图。

漂移管（DT）温度研究

研究

结论

本研究调查了新的、快速的、可靠的和有效的分光光度法及HPLC-ELSD方法，用于测定基于SLNs的左氧氟沙星递送系统中的含量和包封率。这些方法可以在不进行任何样品预处理的情况下，测定所制备SLNs制剂中左氧氟沙星的含量。根据统计分析，该方法适用于对制备的混悬液中的左氧氟沙星进行分析，且不受赋形剂的干扰。已证明

局限性

本研究主要设计为分析调查，用于开发和验证直接测定固体脂质纳米颗粒脂质相中包封的左氧氟沙星的定量方法。因此，制剂层面的生物学评价——如优化SLNs分散液的抗微生物敏感性测试以及体外/离体角膜渗透研究——未在当前范围内开展。这些实验，连同全面的

CRediT作者贡献声明

Miranda F. Kamal：撰写 – 审阅与编辑，项目管理，方法论，数据管理，概念化。Rana M. Moustafa：撰写 – 原稿撰写，资源，方法论，调查研究。Nancy Abdel Hamid Abou Youssef：监督，方法论，调查研究。Mariam Zewail：验证，监督，方法论。Rasha M. Youssef：撰写 – 审阅与编辑，可视化，数据管理，概念化

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

资金支持

本研究未获得公共、商业或非营利部门基金机构的专项资助。

利益冲突声明

作者声明未与任何个人或组织存在利益冲突。

Miranda F. Kamal|Rana M. Moustafa|Nancy Abdel Hamid Abou Youssef|Mariam Zewail|Rasha M. Youssef