流感感染细胞中不同硫酸软骨素水平下的MEK/ERK信号通路及Bcl-2家族蛋白变化

《Journal of Molecular Biology》：MEK/ERK signaling and Bcl-2 family protein changes in influenza-infected cells with differing sulfatide levels

　　

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  硫酸神经节苷脂富集细胞表现出增强的流感病毒入侵后产生量。
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  U0126处理可降低ERK磷酸化和流感病毒产量。
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  较高的SulCOS1产量并未伴随HA/NP蛋白或RNA水平升高。
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  流感感染与Bim减少和Bcl-2家族蛋白变化相关。
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  Bax靶向肽增强MDCK细胞中A型和B型流感病毒的产生。

引言

甲型流感病毒（IAV）仍然是持续存在的全球健康威胁，通过抗原性变化和跨物种传播导致每年季节性流行以及偶尔的大流行，给全球带来巨大的发病率、死亡率和经济社会负担 ^{1, 2}。

高效的IAV复制需要协调的宿主过程，包括新合成的病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的核输出。除了已知的入侵过程中唾液酸受体结合外，病毒血凝素（HA）还可结合硫酸化糖鞘脂硫酸神经节苷脂 ^{3, 4, 5}。宿主细胞中硫酸神经节苷脂的表达可促进vRNP核输出，并增加具有感染力的子代病毒产量 ^{6, 7}。然而，胞外硫酸神经节苷脂-HA相互作用如何转化为驱动vRNP输出的胞内信号仍不清楚。

多种宿主信号网络参与流感感染，多项研究已将快速加速纤维肉瘤（Raf）/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）级联反应与包括vRNP核输出在内的晚期复制事件联系起来 ^{8, 9}。此外，IAV会操纵程序性细胞死亡通路，以平衡应激反应与维持足够长存活期以满足基因组复制、输出和组装的需求 ^{10, 11, 12}。脂质介导的线索如何与这些信号和线粒体检查点交叉以促进有效复制尚未完全阐明。

凋亡是流感感染的常见结局，先前的研究提出激活凋亡效应性半胱天冬酶可促进病毒产生。特别是，据报道半胱天冬酶-3激活对于通过促进vRNP从核内输出实现高效的流感病毒传播是必需的^[13]，半胱天冬酶活性还可通过改变核孔功能来调节核质运输^[14]。相反，硫酸神经节苷脂相关复制与由病毒PB1-F2启动的半胱天冬酶-3非依赖性凋亡信号有关，表明可以激活多种依赖于背景条件的细胞死亡和输出控制通路^[7]。

在这里，我们探讨了硫酸神经节苷脂相关的IAV复制增强是否需要半胱天冬酶-3信号，以及更广泛地，在硫酸神经节苷脂表达细胞中哪些宿主通路与有效病毒产量相关。使用硫酸神经节苷脂低表达和硫酸神经节苷脂富集细胞体系，我们观察到MEK/ERK通路活性、NP定位以及线粒体凋亡相关蛋白丰度的差异。值得注意的是，感染后发生半胱天冬酶-3激活，但在测试条件下全半胱天冬酶抑制并未明显降低HA滴度，而Bax靶向肽则增加了MDCK细胞中的病毒产量。

章节摘要

硫酸神经节苷脂丰度和流感病毒产量在MDCK、COS7和SulCOS1细胞中有所不同

为了验证本研究中使用的细胞体系的硫酸神经节苷脂状态，我们采用流式细胞术和免疫荧光图像分析定量测定了Madin–Darby犬肾（MDCK）（内源性硫酸神经节苷脂）、COS7（硫酸神经节苷脂低表达）和SulCOS1（通过表达CGT和CST富集硫酸神经节苷脂）细胞中的硫酸神经节苷脂表达。SulCOS1是通过引入硫酸神经节苷脂合成酶CGT和CST由COS7衍生而来的细胞系，为硫酸神经节苷脂低表达与

讨论

我们的研究描述了在不同硫酸神经节苷脂水平的细胞体系中流感病毒感染期间MEK/ERK信号、NP定位以及线粒体凋亡相关蛋白的变化。我们首先通过流式细胞术和免疫荧光图像分析确认了细胞体系的不同硫酸神经节苷脂状态，并证明硫酸神经节苷脂富集或硫酸神经节苷脂表达细胞产生的具有感染力的病毒产量高于硫酸神经节苷脂低表达COS7细胞，但并未伴随相应的数量增加

方法

伦理声明

本研究使用已建立的细胞系进行，不涉及人类参与者、人体标本或动物实验。因此不需要伦理批准和知情同意。所有涉及流感病毒的工作均在具有机构授权许可的BSL-2设施中进行。

统计学方法

数据以均数±标准差（SD）或均数±标准误（SE）表示，如文中所述。统计检验（如Dunnett's或Tukey's事后检验）和显著性阈值在各图注中定义。

数据可用性：

本研究使用的数据集可从通讯作者处合理索取。

CRediT作者贡献声明

大西慎太郎（Shintaro Onishi）：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，可视化，验证，方法论，调查研究，正式分析，数据整理，概念设计。仓林优希（Yuki Kurebayashi）：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，方法论，调查研究，正式分析，数据整理，概念设计。高桥忠信（Tadanobu Takahashi）：撰写——审阅与编辑，资源，方法论。原口直人（Naoto Haraguchi）：方法论，调查研究，数据整理。斋藤裕（Yu Saito）：方法论，调查研究，

资金支持

本研究由花王株式会社资助。大西慎太郎和森拓也（Takuya Mori）是花王株式会社的员工。除署名作者之外的贡献外，资助方在研究设计、数据收集与分析、结果解释、手稿撰写或提交决定中没有额外的作用。

利益冲突声明

大西慎太郎和森拓也是花王株式会社的员工。花王株式会社提供了资金和薪资支持。除署名作者之外的贡献外，该公司在研究设计、数据收集、分析、结果解释、手稿撰写或提交决定中没有额外的作用。

致谢

我们感谢同事们的技术建议和试剂支持，包括对HA检测（血液采集）的贡献。我们要感谢Editage（www.editage.jp）提供的英语语言编辑服务。

大西慎太郎|仓林优希|高桥忠信|原口直人|斋藤裕|西出安寿|塚本洋平|竹内秀之|森拓也|铃木隆