ACP5阳性巨噬细胞在创伤性脑损伤后脑水肿与神经炎症中的作用机制及靶向干预研究

《Clinical and Translational Medicine》：ACP5-positive macrophages contribute to cerebral oedema and neuroinflammation after traumatic brain injury

　　

摘要专业翻译 背景 创伤性脑损伤（TBI）是全球致死和长期致残的主要原因之一。由神经炎症和血脑屏障（BBB）破坏驱动的继发性脑水肿，是决定不良预后的关键因素，然而目前仍缺乏有效的靶向治疗策略。本研究旨在鉴定与TBI后脑水肿相关的免疫细胞亚群，并在临床前模型中探索其功能贡献。 方法 研究人员整合了小鼠TBI模型的单细胞转录组数据集（GSE175430）和人类脑出血（ICH）血肿周围水肿样本数据集（GSE266873），并结合此前发表的时序性批量RNA测序数据。通过跨物种比较分析、Mfuzz聚类、AUCell评分和基因集富集分析（GSEA），研究人员将Acp5鉴定为水肿相关特征基因，其巨噬细胞富集表达模式得到单细胞分析和免疫荧光共定位的支持。研究人员采用控制性皮质撞击（CCI）模型，验证了Acp5在不同损伤严重程度下的表达动态。通过药理学抑制（AubipyOMe）和Acp5基因敲除，评估了脑水肿、神经炎症、神经功能和长期认知恢复的变化。 结果 研究人员发现了一群此前未被识别的ACP5阳性单核细胞/巨噬细胞，在损伤后1–3天内浸润脑实质，与水肿严重程度和神经功能缺损的高峰期一致。抑制ACP5可显著降低脑含水量、BBB渗漏和促炎细胞因子水平，同时改善感觉运动功能。在机制上，ACP5阳性巨噬细胞与CSF2相关的JAK/STAT和NF-κB信号通路有关。基因Acp5敲除减弱了急性巨噬细胞浸润和神经炎症，并与长期行为学结局的改善相关。 结论 ACP5阳性巨噬细胞代表了一群与损伤相关的髓系细胞群体，在实验性TBI后促进神经炎症和水肿相关表型。药理学和遗传学证据为ACP5及CSF2相关信号通路在TBI继发性损伤中的进一步研究提供了临床前依据。

论文解读

一、研究背景与科学问题

创伤性脑损伤（TBI）是由外部机械力导致的脑损伤和神经功能障碍，是全球致死和长期致残的主要原因之一。TBI后的病理生理过程涉及一系列复杂级联事件，包括神经炎症、神经元损伤及潜在的长期神经功能损害。继发性脑水肿是决定TBI不良临床结局的关键因素，其发生机制与神经炎症和血脑屏障（BBB）破坏密切相关。目前针对脑水肿的治疗策略主要旨在降低颅内压（ICP）和维持脑灌注压，包括使用甘露醇和高渗盐水等渗透性药物。然而，这些治疗缺乏靶向性，只能暂时降低ICP，无法解决与BBB破坏相关的潜在分子机制，且存在明显副作用。值得注意的是，传统渗透疗法在某些重度TBI患者中的应用仍存在争议，且有ICP反跳效应的显著风险。尽管已有若干针对新靶点的研究涌现，但目前仍缺乏针对TBI潜在病理生理机制的成熟靶向治疗策略，这凸显了新的机制见解和靶向干预手段的迫切需求。

当大脑遭受机械损伤时，其过程往往复杂而持久，涉及直接的原发性损伤、随后的继发性损伤以及神经修复与再生的过程。在急性期，中枢神经系统（CNS）驻留细胞和外周炎症细胞均迅速反应，随后释放炎症介质。这一现象主要归因于小胶质细胞和星形胶质细胞等CNS驻留细胞。BBB是TBI结局的关键决定因素，其破坏加剧了血管源性水肿、炎症浸润和继发性神经元损伤。尽管TBI后BBB的破坏已被充分记录，但驱动这一过程的细胞效应物仍存在争议。既往研究表明，炎症细胞的募集是TBI后的独立病理过程。单核细胞来源的巨噬细胞是急性TBI的关键固有免疫应答细胞，可能在早期有害炎症和后续有益修复中发挥重要作用。然而，特定巨噬细胞亚群是否导致急性BBB功能障碍仍不清楚，这一知识空白阻碍了针对损伤早期稳定神经血管单元的靶向治疗开发。

二、研究内容与总体结论

研究人员采用整合多组学方法阐明TBI后外周免疫浸润的异质性。分析揭示了一群独特的ACP5阳性巨噬细胞亚群，在TBI后1–3天内优先聚集于受损脑区。该亚群与脑水肿严重程度和神经功能缺损密切相关，提示其在疾病急性期进展中的潜在功能作用。值得注意的是，针对该分子亚群的靶向干预减轻了神经炎症并改善了神经功能，为ACP5在急性TBI中的进一步研究提供了临床前证据。总体而言，ACP5阳性巨噬细胞代表了一群与损伤相关的髓系细胞群体，在实验性TBI后促进神经炎症和水肿相关表型。药理学和遗传学证据支持ACP5及CSF2相关信号通路在TBI继发性损伤中的进一步研究价值。

三、主要关键技术方法

研究人员整合了小鼠TBI模型单细胞数据集GSE175430（采用CCI模型，对照组和TBI组各3个生物学样本）和人类ICH水肿数据集GSE266873（9个样本分为3组：出血后0–6 h、6–24 h和24–48 h），并结合此前发表的时序性批量RNA测序数据（sham、TBI-6 h、TBI-12 h、TBI-1 d、TBI-3 d和TBI-7 d）。通过Mfuzz聚类、AUCell评分和GSVA分析鉴定水肿相关基因特征。在动物实验中，采用CCI模型建立轻度和重度TBI模型，使用AubipyOMe进行药理学抑制，使用Acp5基因敲除小鼠进行遗传验证，并开展重组小鼠CSF2体内回补实验。体外实验使用RAW264.7细胞系，通过siRNA敲低Acp5并结合LPS刺激建立炎症模型。评估手段包括脑含水量测定、Evans blue BBB通透性检测、3 T小动物MRI、流式细胞术、免疫荧光、免疫组化、Western blot、RT-qPCR、ELISA、Transwell迁移实验及多种行为学测试（NSS、转棒、抓绳、平衡木、Morris水迷宫、旷场实验）。

四、研究结果

4.1 通过批量RNA-seq鉴定脑水肿相关基因及其时间表达动态

研究人员通过GeneCards检索和Mfuzz聚类分析，从时序性批量RNA-seq数据中鉴定出97个与脑水肿密切相关的基因，其表达在TBI后3天达到峰值。该基因集包含水转运和离子稳态相关基因（Aqp4、Aqp9、Slc12a2、Atp1a2、Trpm4、Trpv4）以及BBB完整性和血管功能相关基因（Cldn5、Ocln、Tjp1、Tjp2、Esam、Angpt1）。GSVA评分与MRI衍生的水肿体积呈强正相关（r = .8554，p = .0016），验证了该分子特征与影像学水肿的相关性。

4.2 单细胞RNA测序揭示TBI后3天脑水肿评分显著升高

对GSE175430数据集（71 660个细胞）的分析显示，TBI组水肿相关评分显著高于对照组，62.53%的TBI组细胞属于高水肿评分类别，而对照组仅为34.15%。高水肿评分细胞中显著富集代谢和炎症通路，包括氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、ECM受体互作、Nod样受体信号通路和Toll样受体信号通路。

4.3 批量与单细胞RNA-seq鉴定Acp5为TBI后水肿关键特征基因

通过跨物种比较分析，研究人员整合了小鼠TBI和人类ICH数据中的差异表达基因、与水肿评分高度相关基因及批量RNA-seq上调基因，取交集获得9个关键特征基因。GO富集分析显示这些基因与炎症和免疫调节显著相关，包括免疫效应过程调控、炎症反应调控、活性氧代谢过程、肿瘤坏死因子超家族细胞因子产生和髓系白细胞细胞因子产生。值得注意的是，所有通路共享一个共同基因——Acp5。

4.4 单细胞分析鉴定ACP5在TBI后主要表达于单核细胞/巨噬细胞

在小鼠GSE175430数据集中，Acp5表达在损伤后3天升高，主要分布于单核细胞/巨噬细胞。在人类GSE266873数据集中，ACP5表达在出血后24–48 h达峰，同样富集于单核细胞/巨噬细胞。ACP5高表达巨噬细胞富集能量代谢相关通路。轨迹分析提示ACP5高表达细胞富集于单核细胞/巨噬细胞分化的终末阶段，该模式跨物种保守。细胞互作分析预测ACP5高表达单核细胞/巨噬细胞在TBI后具有最高的信号发送和接收强度，涉及SPP1、GALECTIN、MIF、VEGF和IL-1等促炎通路。免疫荧光证实ACP5与F4/80阳性巨噬细胞共定位。

4.5 ACP5时间表达动态、损伤相关性及细胞定位

在CCI模型中，Acp5表达与TBI严重程度显著正相关，重度TBI小鼠在损伤后3天的Acp5 mRNA和ACP5蛋白水平均显著高于轻度TBI。ACP5表达在损伤后逐渐升高，于3天达峰后逐渐下降。免疫荧光显示外周巨噬细胞在正常脑组织中浸润极少，损伤后1天浸润最少，3天时F4/80表达在损伤区域达到最高水平。H&E染色显示时间依赖性的TBI后病理改变，包括血管周围间隙增宽和实质染色密度降低，这些改变通常与水肿相关。

4.6 ACP5抑制改善TBI后血脑屏障完整性和神经功能

AubipyOMe在RAW264.7细胞中浓度依赖性地抑制ACP5酶活性，且在10 μM以下浓度无显著细胞毒性。体内安全性评估显示，短期AubipyOMe给药方案未引起明显的血液学、肝脏或肾脏毒性，主要器官未见治疗相关的病理改变。AubipyOMe治疗后，损伤周围脑组织中Acp5 mRNA和ACP5蛋白水平降低，紧密连接蛋白OCCLUDIN表达恢复，Evans blue渗漏显著减少，MRI显示脑水肿体积减小，损伤半球脑含水量显著降低。NSS、转棒、抓绳和平衡木测试均显示AubipyOMe治疗后神经功能显著改善。

4.7 ACP5抑制减少TBI后3天脑组织浸润巨噬细胞积累

流式细胞术分析显示，TBI后外周浸润巨噬细胞（CD45^highCD11b+F4/80+）显著浸润，ACP5抑制后其比例显著下降。小胶质细胞（CD45^lowCD11b+）在TBI后显著增加，但AubipyOMe给药后无显著变化。免疫荧光分析进一步证实AubipyOMe组F4/80荧光强度显著低于对照组。

4.8 ACP5扰动与CSF2相关的JAK/STAT和NF-κB信号通路相关

RNA测序显示AubipyOMe处理后Toll样受体信号通路、Nod样受体信号通路、胞质DNA传感通路、细胞黏附分子、白细胞跨内皮迁移和ECM受体互作等通路负富集。GSEA显示JAK-STAT相关转录程序在AubipyOMe处理后减弱。ELISA显示AubipyOMe给药后损伤周围脑组织CSF2浓度降低。Western blot证实CSF2、p-JAK1、p-STAT3、p-NF-κB p65和IL-1β蛋白水平显著降低，RT-qPCR显示经典促炎因子表达大幅下降。在RAW264.7细胞中，siRNA敲低Acp5后JAK-STAT信号通路显著抑制，Transwell实验显示Acp5敲低显著抑制巨噬细胞迁移。外源性CSF2部分恢复了Acp5敲低后的下游信号和炎症基因表达，支持CSF2作为ACP5相关炎症反应的候选介导因子。

4.9 全局Acp5敲除减弱急性炎症表型并改善TBI后长期行为学结局

Acp5-KO小鼠在TBI后3天，损伤周围脑组织中CSF2、p-JAK1、p-STAT3、p-NF-κB p65和IL-1β表达显著低于WT TBI对照。CSF2回补实验部分恢复了Acp5-KO TBI小鼠中p-JAK1、p-STAT3、p-NF-κB p65和IL-1β的水平。免疫荧光显示Acp5-KO小鼠损伤半球F4/80阳性巨噬细胞积累减少。在TBI后28天的长期行为学评估中，旷场实验显示Acp5-KO TBI小鼠在总移动距离、中央区停留时间、中央区移动距离和活动时间比例方面均显著优于WT TBI小鼠。Morris水迷宫训练阶段，Acp5-KO小鼠逃逸潜伏期呈缩短趋势；探针测试中，Acp5-KO TBI小鼠的平台首次进入潜伏期更短、平台穿越次数更多、目标象限停留时间更长、目标象限进入次数更多。在sham条件下，Acp5-KO与WT小鼠之间无显著基线差异。

五、讨论总结与研究结论

脑水肿是TBI后的危及生命的并发症，在神经重症监护中构成重大临床挑战。根据Monro-Kellie学说，脑水肿导致的脑容积增加会迅速升高ICP，而ICP升高已被确定为TBI、卒中等颅内病变患者预后不良的预测因子。尽管渗透治疗、镇静和手术干预等标准治疗被广泛采用，但这些方法对神经结局的影响甚微。本研究中使用的水肿相关评分应被理解为复合分子代理指标而非组织含水量的直接测量。97基因特征主要富集于BBB完整性、血管通透性、血管调节和组织稳态相关过程，同时包含直接参与水转运和离子稳态的基因。该评分与MRI衍生水肿体积的相关性支持其生物学相关性。

ACP5（抗酒石酸酸性磷酸酶5，TRAP/ACP5）是一种相对保守的多功能蛋白，定位于人类19号染色体19p13.2–p13.3位点，可参与活性氧的产生和巨噬细胞功能的调控。研究表明ACP5主要表达于髓系细胞，包括粒细胞和单核吞噬细胞，尤其作为破骨细胞的标志物。ACP5在不同细胞类型中的活性和功能可能有所差异。尽管ACP5存在生理性表达，其在多种病理状态中可观察到水平升高，如恶性肿瘤、戈谢病等代谢性疾病和骨发育异常。然而，ACP5在神经系统中的作用在很大程度上仍未得到充分探索。本研究首次报道ACP5可能参与TBI后的继发性损伤。

尽管CNS驻留的小胶质细胞和星形胶质细胞传统上被视为TBI后神经炎症反应的主要介导者，但全身循环免疫细胞和炎症分子在TBI中同样发挥重要作用。本研究通过整合多组学方法，鉴定出ACP5阳性单核细胞/巨噬细胞这一与TBI后脑水肿和神经炎症相关的髓系细胞群体。药理学抑制和遗传敲除ACP5均能减轻炎症表型并改善功能结局，CSF2相关的JAK/STAT和NF-κB信号通路可能参与ACP5相关的神经炎症反应。尽管ACP5与该信号轴之间的直接分子关系尚待阐明，这些发现支持ACP5作为TBI继发性损伤进一步研究的临床前候选靶点。