《Methods in Ecology and Evolution》：EMITS: Expectation–maximization abundance estimation for fungal ITS communities from long-read sequencing
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随着长读长扩增子测序成为真菌代谢条形码分析的常规手段，基于ITS扩增子的物种水平丰度估计仍受限于朴素的最高匹配分类法。将每条读段分配给其单一最高得分参考序列的做法，会在共享相似ITS序列的近缘物种间错误分配读段，并将同一物种的读段分散到数据库中代表该物种的多个
随着长读长扩增子测序成为真菌代谢条形码分析的常规手段，基于ITS扩增子的物种水平丰度估计仍受限于朴素的最高匹配分类法。将每条读段分配给其单一最高得分参考序列的做法，会在共享相似ITS序列的近缘物种间错误分配读段，并将同一物种的读段分散到数据库中代表该物种的多个冗余条目上，导致没有任何单个条目能反映其真实丰度。针对全长16S rRNA开发的期望最大化（EM）方法，特别是EMU（Curry等人，2022），近期已在真菌ITS代谢条形码分析中得到基准测试（Graetz等人，2025），但将EMU应用于ITS需要构建自定义参考数据库，并使用最初针对16S调整的参数。本研究介绍了EMITS，一款基于Rust语言的工具，它应用EM算法对来自minimap2比对到UNITE数据库的结果进行迭代解析模糊读段与参考序列之间的映射关系，从而产生概率性的物种水平丰度估计。EMITS提供UNITE原生头文件解析功能，可自动聚合登录号；针对当前牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore，ONT）R10.4.1、R9.4.1、Duplex化学试剂和太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences，PacBio）HiFi化学试剂提供了经验性调整的平台预设参数；并与ITSxRust（O'Brien等人，2026b）集成以实现上游ITS区域提取。研究人员使用三种互补的方法验证了EMITS，并将其与朴素最佳命中计数法和EMU（使用UNITE格式的参考数据库）进行了基准比较。在受控模拟实验中，在现实噪声条件下，EM相比朴素计数法将L1误差降低了80%–92%。对于美国典型培养物保藏中心（ATCC）真菌ITS模拟群落，EMITS在分类学上具有挑战性的属内提供了优越的种级分辨率：它正确鉴定了须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）（2.21%），而EMU将大量丰度错误地归因于断发毛癣菌（T. tonsurans）（1.54%）；它将产红青霉（Penicillium rubens）假阳性抑制到0.002%，而EMU为0.58%；并且更准确地跨UNITE登录号整合了光滑纳克酵母（Nakaseomyces glabratus）的丰度（12.40%对比EMU的9.95%）。在一个包含21个物种、缺乏显著属内分类难度的合成UNITE群落中，所有三种方法均以100%的灵敏度检测到预期物种，总L1误差分别为8.64%（朴素法）、7.30%（EMITS）和6.71%（EMU）。结合用于上游ITS提取的ITSxRust，EMITS提供了一个专为长读长真菌扩增子分析优化的从提取到丰度的完整工作流程。该工具的原生UNITE处理能力和ITS特异性参数预设解决了生态学家在使用长读长测序时面临的具体采用障碍，而其展示出的属内种级分辨率优势则瞄准了最具临床、农业和生态重要性的、分类学上具有挑战性的真菌属。
研究背景与问题
真菌核糖体DNA的内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）是真菌鉴定的一级条形码，也是真菌学中测序最广泛的标记。长读长测序技术的进步，特别是牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）和太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences，PacBio），使得全长ITS扩增子测序日益普及，相较于仅靶向ITS1或ITS2亚区的短读长方法，提供了更高的分类分辨率。然而，当前对长读长平台ITS扩增子的分类方法通常依赖比对方法（如minimap2或BLAST比对到UNITE数据库），随后进行朴素最佳命中分配：每条读段被完全分配给比对分数最高的参考序列。这种方法存在两个公认的局限性：第一，来自ITS序列近乎相同的物种的读段可能对多个参考序列得分几乎相同，导致丰度在近缘物种间的错误归属，这在曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）和毛癣菌属（Trichophyton）等分类学上具有挑战性的属中尤为严重。第二，像UNITE这样的综合参考数据库包含每个物种的多个登录号，朴素计数法将每条读段提交给单个登录号，导致一个物种的读段分散在所有代表它的条目上，没有哪个条目能承载该物种的全部丰度。此外，读段准确性会加剧这一问题，因为较高的每读段错误率会侵蚀本可以区分这些条目的分数差异。
为解决这些问题，研究人员开发了EMITS，一款专门为长读长测序真菌ITS群落实现基于期望最大化（Expectation-Maximization，EM）丰度估计的工具。EMITS贡献了：（i）原生解析UNITE和EUKARYOME FASTA头文件，包括跨冗余登录号的自动物种水平聚合；（ii）针对当前ONT化学试剂（R10.4.1、R9.4.1、Duplex）和PacBio HiFi的经验性调整参数预设；（iii）与ITSxRust的集成，形成端到端的分析流程；（iv）在分类学上具有挑战性的属内，相对于朴素最佳命中计数法和为ITS适配的EMU，展示了可证明改善的种级分辨率。
主要技术方法
EMITS是一款用Rust语言实现的基于EM的丰度估计器。其设计采纳了EMU建立的概率框架，并针对ITS区域进行调整。该工具接受来自minimap2的PAF（Pairwise mApping Format）格式比对文件。EMITS执行EM丰度估计算法，并在跨参考登录号聚合后报告物种水平丰度。头文件解析支持UNITE和EUKARYOME通用FASTA版本。平台预设定义了温度参数（τ）和最小一致性阈值。模拟读段集使用badread v0.4.1生成，ONT条件使用随机错误模型，PacBio HiFi条件使用pacbio2021错误和质量评分模型。验证数据集包括：受控模拟实验（六物种三属群落和四物种黑曲霉组场景）、ONT真菌ITS模拟群落（ATCC MSA-1010，含10种真菌，GridION R10.4.1测序，三个生物学重复）、21物种合成UNITE群落（涵盖六个多物种属和五个单物种属，含两个1%丰度的稀有物种）以及PacBio HiFi模拟实验。
研究结果
3.1 模拟实验表明EM对比对噪声具有鲁棒性：在受控模拟中，无噪声时两种方法表现相当；一旦引入噪声，朴素计数法误差急剧增加，而EM保持稳定。在±30分数噪声下（约6%的最佳命中不正确），EM将L1误差降低80%；在±50噪声（22%错误最佳命中）下改进达90%；在±60噪声（28%错误）下达92%。在黑曲霉组模拟中，EM将L1误差降低91%。EM的L1误差几乎恒定（约0.014），而朴素误差从0.023攀升至0.275。
3.2 ONT模拟群落：属内种级分辨率：在10物种ATCC模拟群落中，EMITS检测到所有10个预期属，99.95%的总丰度分配到预期分类群。EMITS的关键优势体现在属内种级水平。在毛癣菌属（Trichophyton）中，EMITS将2.21%分配给须癣毛癣菌（T. mentagrophytes）（正确物种），而朴素法仅0.39%，EMU正确识别但额外将1.54%错误归因于断发毛癣菌（T. tonsurans）。在青霉属（Penicillium）中，EMITS将2.85%分配给产黄青霉（P. flavigenum），抑制了朴素法的误配和EMU引入的产红青霉（P. rubens）误配（0.002%对比0.58%）。在曲霉属（Aspergillus）中，EMITS和EMU表现相当，均正确识别烟曲霉（A. fumigatus）。在纳克酵母属（Nakaseomyces）中，EMITS通过分类聚合整合了12.40%的光滑纳克酵母（N. glabratus），而EMU仅为9.95%。
3.3 合成群落：种级分辨率和假阳性抑制：在21物种合成群落中，三种方法均以100%灵敏度检测到所有物种。总L1误差为朴素法8.64%、EMITS 7.30%、EMU 6.71%。EMITS将总L1误差相对朴素法降低15.6%。在多物种属中，EMITS在所有存在显著属内歧义的属中估计的物种丰度更接近真实值，在青霉属中改进最为显著。假阳性丰度方面，EMITS为0.89%，朴素法为1.83%，降低51%，在青霉属内假阳性丰度降低63%。
3.4 PacBio HiFi：预设验证与修正：在PacBio HiFi精度下的21物种群落评估显示，原始发布的预设因最小比对质量过滤（MAPQ 5）导致无改进，该过滤移除了25.9%的比对，消除了EM可处理的歧义。移除该过滤后，EM相对朴素计数的改进达到20.8%，高于ONT数据上的15.6%。研究发现迭代上限100截断了EM收敛（合成群落需232次迭代），现修正为500。HiFi温度参数τ=0.15收敛速度比ONT值快2.5倍，且L1更低、假阳性丰度减半。
讨论与结论
EMITS证明了专为真菌ITS群落构建并针对当前长读长化学试剂调整的EM丰度估计框架，能在分类学上具有挑战性的属内提高种级分辨率。改进通过三个机制实现：解决ITS序列重叠时的属内歧义、跨冗余UNITE登录号整合丰度、抑制假阳性物种调用。EMITS的优势程度取决于数据集的比对歧义程度。ATCC真菌ITS模拟群落提供了最有信息的比较，EMITS的设计选择在此数据集上显示出优于EMU的具体优势。这些差异源于具体设计选择：EMITS的平台特异性温度参数（τ）是基于ITS数据经验性调整的，而EMU使用最初针对16S校准的单套内部参数。需要注意的是，ITS本身比16S rRNA更具变异性，因此真正歧义读段的比例较低，EM方法的总体改进更为温和。然而，ITS重叠确实发生的属——曲霉属、镰刀菌属、青霉属、木霉属、念珠菌属、毛癣菌属——恰恰是最具临床、农业和生态重要性的属。
研究结论：EMITS与ITSxRust互补，覆盖了长读长真菌扩增子分析中从提取到丰度的阶段。它不是完整的分析流程，上游质量控制、嵌合体检测和聚类不在其范围内。内存扩展、收敛速率、扩增偏差、模拟真实性、温度调优、外部比对依赖性和数据库范围是需要考虑的局限性。EMITS以MIT许可证发布，源代码、模拟脚本、EMU参考数据库构建脚本和图形生成代码均可获取。
