CALR突变型骨髓增殖性肿瘤对TYK2信号的选择性依赖

《Leukemia》：Selective dependency of CALR-mutant myeloproliferative neoplasms on TYK2 signaling

　　

骨髓增殖性肿瘤（MPN）由致癌蛋白JAK2V617F、突变型钙网蛋白（CALR）和突变型血小板生成素受体（TPOR；MPL）驱动，这些致癌蛋白均激活JAK/STAT信号通路。尽管JAK2信号在所有MPN中均被激活，但TYK2在JAK2V617F驱动的疾病中是非必需的。研究人员假设TYK2在CALR突变驱动的MPN中发挥独特作用。研究发现，在CALRdel52/ins5和MPLW515K表达细胞中存在组成性TYK2磷酸化，而JAK2V617F表达细胞中则无此现象。结构建模预测JAK2和TYK2与TPOR的结合亲和力相似，而微图案实验证明JAK2WT和JAK2V617F均能将TYK2从受体上置换下来。TYK2抑制剂deucravacitinib降低了CALRdel52/ins5和MPLW515K突变细胞的活力及STAT3/5磷酸化，但对JAK2V617F突变细胞无此效应，且与JAK2选择性抑制剂fedratinib联用时疗效增强。细胞反应与JAK2蛋白丰度相关，因为CALRins5 JAK2^high克隆在TYK2抑制时胜过JAK2^low克隆。在原代样本中，deucravacitinib显著抑制ET和PMF（而非PV）的集落生长，并选择性降低CALR（而非JAK2V617F）突变等位基因负荷。同样，CALR突变患者特异性iPSC来源的CD34⁺祖细胞表现出更高的TYK2磷酸化，并且比JAK2V617F对应细胞对TYK2抑制更敏感。这些发现将TYK2确定为CALR突变MPN的选择性弱点，并支持联合TYK2/JAK2抑制策略以克服JAK2依赖性耐药。

**CALR突变型骨髓增殖性肿瘤对TYK2信号的选择性依赖：研究解读**

**研究背景与目的**

经典费城染色体阴性骨髓增殖性肿瘤（MPN）包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF），其发病主要由三个驱动基因突变介导：JAK2V617F、钙网蛋白（CALR）基因移码突变以及血小板生成素受体（TPOR，由MPL基因编码）突变。这些突变均异常激活JAK/STAT信号通路。虽然JAK1/2抑制剂ruxolitinib已在临床中用于治疗MF和PV，且TYK2在JAK2V617F驱动的疾病中被证实为非必需，但TYK2在CALR突变型MPN中的作用此前缺乏系统研究。研究人员据此提出假设：TYK2在CALR突变驱动的MPN中具有独特且可靶向的功能，并系统比较了CALR/MPL突变与JAK2V617F突变细胞对TYK2信号的依赖差异。

**关键研究方法**

研究采用多种互补的技术策略。患者外周血样本来自德国亚琛工业大学医院血液科和输血科，包括ET（9例）、PV（4例）、PMF（11例）患者及健康对照（5例），所有样本均获得伦理批准和知情同意。主要方法包括：集落形成单位（CFU）实验及克隆性变异等位基因频率（VAF）计算；CRISPR/Cas9基因编辑（nuclease与nickase两种策略）靶向TYK2；免疫印迹检测蛋白磷酸化水平；MTT法及凋亡染色评估细胞活力；活细胞微图案技术定量TYK2与TPOR在质膜上的结合；分子动力学模拟与MM-PBSA计算预测蛋白结合自由能；以及将患者特异性诱导多能干细胞（iPSC）定向分化为CD34⁺造血干/祖细胞（HSPC）用于药物敏感性验证。

**研究结果**

**TYK2在CALR突变细胞中而非JAK2V617F突变细胞中组成性磷酸化**

通过免疫印迹检测多种细胞系（32DMPL、TF-1MPL）的基底状态，研究人员发现CALRdel52突变细胞中TYK2磷酸化（pTYK2）水平显著高于JAK2V617F突变细胞。TPO刺激虽可诱导各基因型细胞pTYK2升高，但CALRdel52细胞中的诱导程度最低。结构建模预测TYK2与TPOR的结合亲和力与JAK2相当；活细胞微图案实验进一步证明，JAK2野生型（WT）和JAK2V617F均能将TYK2从TPOR上竞争性置换，提示JAK2高表达可影响TYK2受体占有率。

**TPOR/TYK2相互作用对CALRdel52诱导的信号至关重要**

研究人员利用两种CRISPR/Cas9策略产生pTYK2缺陷克隆。策略2（nickase）在JAK2V617F细胞中可获得克隆，但无法在CALRdel52细胞中获得，提示完全破坏TPOR-TYK2相互作用对CALR突变细胞是致死或强选择性的。分子动力学模拟显示，策略2对应的FERM域缺失（del158-223）导致TYK2-TPOR界面氢键减少，结合自由能显著降低，进一步支持TPOR-TYK2相互作用是CALRdel52信号所必需。

**TYK2和JAK2选择性抑制剂联用显示协同效应**

MTT和凋亡实验显示，选择性TYK2抑制剂deucravacitinib显著降低CALRdel52和MPLW515K突变细胞的活力并诱导凋亡，但对JAK2V617F突变细胞无显著影响。在CALRdel52和MPLW515K细胞中，deucravacitinib与JAK2选择性抑制剂fedratinib联用可产生协同效应（药物相互作用系数<0.7），并明显下调pSTAT3和pSTAT5水平；而JAK2V617F细胞对联合治疗不敏感。

**内源性JAK2水平决定deucravacitinib的生物学疗效**

CALRins5突变细胞表达的内源性JAK2蛋白水平高于CALRdel52细胞，且对deucravacitinib反应较差。在CALRdel52细胞中过表达JAK2 WT可使其失去对deucravacitinib的敏感性。单细胞克隆实验证实，JAK2^low克隆对TYK2抑制敏感，而JAK2^high克隆耐药；在共培养体系中，JAK2^high克隆在deucravacitinib存在下可竞争性胜过JAK2^low克隆。

**JAK2^high、CALRins5^low、TPOR^high克隆抵抗deucravacitinib治疗**

流式细胞术分析显示，耐药克隆主要呈现GFP^med/TPOR^high表型（对应JAK2高表达），而敏感克隆以GFP^high/TPOR^med为主（对应JAK2低表达）。经deucravacitinib处理后，耐药群体比例显著增加，进一步说明JAK2高表达和TPOR高表面水平可降低CALR突变细胞对TYK2抑制的依赖。

**对deucravacitinib的表型反应由TPOR而非EPOR依赖性驱动**

原代患者样本CFU实验显示，deucravacitinib显著抑制ET和PMF患者的集落生长，但对PV患者和健康对照无显著影响。在表达TPOR或EPOR的32D细胞中，deucravacitinib对TPOR依赖细胞的作用显著强于EPOR依赖细胞。对集落进行基因分型后，CALR突变集落的克隆性VAF下降幅度显著大于JAK2V617F突变集落，表明TYK2抑制对CALR突变克隆具有选择性清除作用。

**CALR突变HSPC中TYK2磷酸化高于JAK2V617F**

利用患者特异性iPSC分化来源的CD34⁺ HSPC，研究人员发现CALR突变细胞对deucravacitinib的敏感性显著高于JAK2V617F突变细胞，且其基础及ruxolitinib诱导后的pTYK2水平均更高。这再次验证了TYK2信号在CALR突变细胞中的选择性激活。

**讨论与结论**

讨论部分指出，TYK2是CALR突变MPN中一个未被充分认识的治疗弱点。CALR突变可能通过TPOR胞内构象变化激活TYK2，而JAK2V617F通过高表达JAK2竞争性取代TYK2与TPOR的结合，从而降低TYK2的必需性。deucravacitinib对CALR/MPL突变细胞的选择性抑制作用，以及其与fedratinib的协同效应，提示联合靶向JAK2和TYK2可能克服JAK2高表达介导的耐药。原代样本数据进一步支持deucravacitinib在ET和PMF（特别是CALR突变型）中的潜在应用，而PV因主要依赖EPOR信号故反应较差。讨论还强调，患者样本数量有限，结果需更大规模验证。

研究结论可翻译为：这些发现将TYK2确定为CALR突变型MPN的选择性弱点，并支持联合TYK2/JAK2抑制策略以克服JAK2依赖性耐药。