土耳其发酵Tarhana中具有益生潜力的Bacillus分离株的安全性评估

《Food Science & Nutrition》：Safety Evaluation of Bacillus Isolates From Fermented Tarhana With Probiotic Potential

　　

Tarhana是一种土耳其发酵食品，数百年来一直被土耳其人广泛食用。主要发酵微生物是乳酸菌（lactic acid bacteria）；然而，在本研究中，研究人员旨在从Tarhana样品中分离Bacillus菌株，并在鉴定后研究其部分益生特性。研究人员收集了不同类型的Tarhana样品，经过初步筛选测试，选出了53株分离物。这些分离物为革兰氏阳性、产芽孢、过氧化氢酶阳性和运动性菌株。研究人员进行了包括卵磷脂酶、DNA酶（DNase）和溶血活性在内的生化致病性测试，所有分离物均为卵磷脂酶阴性和DNA酶阴性。溶血测试表明，8株分离物为γ-溶血，其余为α-溶血。研究人员调查了所有分离物中的10种毒力基因，未发现任何菌株携带这些基因。分离物对胆盐（78.3%–97.3%）和模拟胃条件（81.3%–99.5%）表现出较强的耐受性。分离物的疏水性潜力变化较大，范围为14.6%–76.2%。24小时后的聚集率为50.4%–79.2%。其中20株分离物为强生物膜形成菌株，并且对Bacillus特异性抗生素敏感（根据EUCAST）。本研究揭示了土耳其Tarhana作为益生Bacillus菌株来源的潜力。

肠道微生物群在维持人类和动物健康中发挥关键作用，益生菌（probiotics）被定义为当摄入足够数量时能够对宿主产生健康益处的活微生物。由于Bacillus属菌株具有形成内生孢子的能力，可有效抵抗胃肠道中的低pH、胆盐和消化酶等不利条件，并耐受工业加工和储存，因而成为益生菌候选菌株中具有显著优势的一类。Tarhana是土耳其传统发酵食品，由小麦粉和酸奶组成的面团发酵1–7天制成，其发酵过程主要由乳酸菌和酵母驱动，但已有研究报道其中也含有适应食品环境的Bacillus物种。尽管Tarhana被广泛消费，但关于从这种传统发酵食品中分离的产芽孢Bacillus物种益生潜力的科学证据仍然有限。因此，本研究旨在对从土耳其传统谷物发酵食品中获得的Bacillus分离株进行全面筛选，以寻找有前景的食品级益生菌候选菌株。

研究人员收集了来自土耳其13个城市的83份自制Tarhana样品，经热处理和稀释涂布后分离出466株细菌，通过初步鉴定和安全性筛选最终选出53株非致病性产芽孢分离株进行深入研究。关键的技术方法包括：采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定；通过卵磷脂酶、DNase、溶血试验及PCR（聚合酶链式反应）检测10种毒力基因进行安全性表征；依据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）标准进行抗生素敏感性测试；并评估了胆盐耐受性、模拟胃液耐受性、细胞表面疏水性、自聚集能力及生物膜形成能力等益生特性。

**3.1 形态学和生化表征**
所有53株分离物均为革兰氏阳性、产芽孢、过氧化氢酶阳性、运动性杆状细菌，具有典型的Bacillus细胞形态。

**3.2 MALDI-TOF MS鉴定**
MALDI-TOF MS分析显示，49株（92.5%）获得可靠鉴定，4株未能可靠鉴定。在鉴定菌株中，Bacillus vallismortis为优势种（22株，44.9%），其次为Bacillus mojavensis（15株，30.6%）和Bacillus subtilis（12株，24.5%），所有鉴定菌株均属于B. subtilis群。

**3.3 安全表征**
**3.3.1 卵磷脂酶活性**：所有分离物在蛋黄琼脂平板上均未产生卵磷脂酶活性，表明其不具有与该酶相关的潜在致病性。
**3.3.2 DNase活性**：所有分离物均未表现出DNase活性，进一步支持其安全性。
**3.3.3 溶血活性**：53株分离物中无β-溶血菌株，8株为γ-溶血，其余为α-溶血。只有β-溶血应被视为有害，因此α和γ溶血菌株可继续用于益生特性评价。
**3.3.4 毒力基因**：通过PCR筛查了腹泻型肠毒素相关基因（nheA、nheB、nheC、hblA、hblC、hblD、bceT、entFM、cytK）和呕吐型毒素合成基因cesB，所有分离物均未携带这些毒力基因。
**3.3.5 抗生素敏感性**：根据EUCAST标准，所有分离物对环丙沙星和左氧氟沙星均被归类为“敏感，增加暴露（I）”，仅分离株#38对红霉素耐药，其余分离物对所测抗生素均敏感，表明其安全性符合益生菌应用要求。

**3.4 益生特性**
**3.4.1 胆盐耐受性**：在0.3%胆盐条件下孵育3小时，分离株存活率范围为78.2%–97.3%，平均为89.14%±4.24%，多数分离株的耐受水平与商业益生菌Bacillus菌株相当或更高，表明其具有较强的肠道胆盐耐受能力。
**3.4.2 模拟胃液耐受性**：在含0.3%胃蛋白酶、pH 2.5的模拟胃液中孵育3小时，分离株存活率范围为81.3%–99.5%，平均为90.95%±3.88%，显示其能较好耐受胃部酸性和酶解环境。
**3.4.3 细胞表面疏水性**：采用细菌粘附烃类（BATH）法以正十六烷测定，疏水性范围为14.6%–76.2%，其中11株分离株疏水性高于50%，且总体高于商业对照菌株，表明其具有较强的肠道上皮粘附潜力。
**3.4.4 自聚集能力**：孵育3小时的自聚集率为16.7%–78.9%，24小时后升至50.4%–87.0%，平均61.03%±6.5%，与商业菌株相当，有助于肠道定殖和病原体竞争性排斥。
**3.4.5 生物膜形成**：结晶紫微板法测定显示，10株为弱生物膜形成者，23株为中等，20株为强生物膜形成者，多数分离株优于弱至中等生物膜形成的商业菌株，提示其具有更好的肠道存活和定殖能力。

**3.5 菌株筛选**
根据上述益生特性的综合热图分析，研究人员从53株中选出12株具有综合优良益生属性的候选菌株，这些菌株来自Kocaeli、Tokat、Mara?、Gaziantep和U?ak 5个城市的Tarhana样品。

讨论部分认为，尽管α-溶血在Bacillus中可能由纤维蛋白溶解酶及脂肽类物质引起，但口服B. subtilis孢子不会穿过黏膜表面，因此仅β-溶血应被视为有害。所有分离株均未检出已知毒力基因，且对EUCAST推荐的相关抗生素基本敏感，进一步支持其安全性。多数分离株在胃肠道耐受性和粘附相关特性上达到或超过商业益生菌Bacillus菌株，显示出作为新型益生菌候选菌株的良好潜力。

结论：本研究证明，来自Tarhana的Bacillus分离株表现出有效益生菌功能所需的多种关键特征。所有分离株在模拟胃肠道条件和胆盐培养基中均表现出高存活率。此外，相当数量的分离株表现出强粘附相关特性，如疏水性、自聚集和生物膜形成，在许多情况下超过了商业益生菌Bacillus菌株的性能。结合表型、生化和致病性测试结果，进一步证实这些分离株属于产芽孢Bacillus物种，被认为是适用于功能性食品应用的安全微生物。总体而言，本研究中分离株表现出的强大胃肠应激耐受性和粘附能力有力地支持其作为有前景的益生菌候选菌株，可在食品和健康相关产业中进一步评估和利用。包括基因组表征、其他益生属性以及功能活性分析（如抗菌潜力和酶产生）在内的进一步研究正在进行中。