海滨苜蓿挥发油的多重生物活性研究：抗氧化、杀虫、对SAF-1细胞体外细胞毒性与抗脂氧合酶活性的体外及计算机模拟评估

《Food Science & Nutrition》：Sea Medick Volatile Oil: Antioxidant, Insecticidal, In Vitro Cytotoxic Activity on SAF-1 Cells and Anti-Lipoxygenase Assessment via In Vitro and In Silico Methods

　　

专业术语翻译摘要 地中海植物海海滨苜蓿（Medicago marina L.），原产于北非、西班牙和中亚，在海岸沙丘的稳定化中发挥重要作用，并具有显著的经济价值。本研究除评估该植物对赤拟谷盗（Tribolium castaneum）的杀虫潜力、抗脂氧合酶（anti-lipoxygenase）活性以及对SAF-1细胞系的细胞毒性（cytotoxic activity）活性外，还评估了其挥发油（essential oil, EO）的抗氧化能力，该挥发油的化学成分已在研究人员先前发表的论文中报道。所观察到的抗氧化效应可能与挥发油组分的还原能力和强电子供体特性有关，并可能部分解释所发现的杀虫活性——与对照组相比，暴露于挥发油1小时后记录了70.70%的驱避率。该挥发油在所用实验条件下表现出显著的体外抗脂氧合酶活性，其半数抑制浓度（IC50）值为0.01 ± 0.002 μg mL?1。此外，分子对接（molecular docking）结果证实，挥发油的五种主要组分能够良好地结合到真核脂氧合酶-5（LOX-5）酶的腔穴中。另外，研究人员将SAF-1细胞系细胞暴露于不同浓度的M. marina挥发油中。研究结果表明，仅在5 mg mL?1浓度下，SAF-1细胞的活力受到显著影响。总之，Medicago marina挥发油除了可作为制药用途的天然抗炎化学物质来源外，还可能是一种环境友好的方式，用于保护储存货物免受虫害侵扰。所观察到的生物活性可能反映了挥发油主要成分的联合效应，特别是与其显著的杀虫、细胞毒性、抗氧化和抗脂氧合酶效应相关。

论文解读

一、研究背景与意义

植物源天然产物在动物健康与疾病管理中的作用及其抗氧化特性正日益受到研究关注。具有抗氧化活性的天然化合物能够通过增强内源性抗氧化防御系统的保护能力来减轻氧化性组织损伤。然而，合成抗氧化剂的不良效应促使研究者积极筛选天然抗氧化剂来源。挥发油（essential oils, EOs）作为从植物中提取的天然化合物，具有杀虫、抗氧化、抗菌等多种生物活性，可作为合成物质的替代品，广泛应用于食品工业、医药、制药和化妆品等领域。

在储粮害虫防治方面，昆虫侵扰是导致储存食品数量和质量损失的主要原因之一。合成农药的过度使用引发了抗药性问题，促使研究人员探索对人类健康和环境风险更低的天然替代方案。精油因其驱避特性而受到关注，可作为商业驱避制剂的基础。

炎症是动物健康的重要问题。人体内的脂氧合酶（lipoxygenases, LOXs）在启动炎症反应中发挥关键作用。鉴于LOX通路的不良方面，脂氧合酶抑制研究具有重要价值。此外，集约化水产养殖中抗生素和化学治疗药物作为预防性干预手段已受到广泛批评，因其对鱼类和环境均产生不利影响，包括免疫抑制、组织中残留积累以及耐药病原体的产生，因此探索天然替代化合物日益受到重视。

海海滨滨苜蓿（Medicago marina L.）属于豆科（Fabaceae）苜蓿属（Medicago），该属包含83个物种，地理分布广泛。此物种分布于西班牙、北非至中亚地区，在沿海沙丘生长繁茂，可用于此类生态系统的稳定和恢复。苜蓿属物种已被认识到具有神经保护、抗氧化、免疫调节、利尿、抗菌、抗生物膜和抗凝血等多种活性。然而，据研究人员所知，此前尚无研究考察M. marina挥发油的细胞毒性活性，且关于这些植物、提取物或挥发油体外效应的研究也较为匮乏。

本研究旨在考察该挥发油的多项生物活性，包括抗氧化、抗脂氧合酶和杀虫活性，并通过分子对接分析其主要成分与LOX-5酶的相互作用，同时评估该挥发油对SAF-1细胞系的细胞毒性效应，以确定该挥发油潜在的新应用价值。

二、主要研究结论

本研究得出以下核心结论：M. marina挥发油具有显著的抗氧化活性，其ABTS自由基清除能力的IC₅₀值为1.7 ± 0.4 mg mL^?1；在2 mg/mL浓度下对赤拟谷盗表现出70.7%的驱避率（Class IV级），但未表现出熏蒸致死活性；在5 mg mL^?1浓度下对SAF-1细胞造成63.2%的细胞死亡，EC₅₀为4.088 mg mL^?1；该挥发油表现出显著的体外抗脂氧合酶活性，IC₅₀值为0.01 ± 0.002 μg mL^?1；分子对接结果显示五种主要成分（α-葎草烯和(E)-β-紫罗酮结合能最佳，均为?5.7 kcal/mol）能够结合到LOX-5酶的活性腔穴中。这些发现表明，M. marina挥发油不仅是制药用途的天然抗炎化学物质来源，还可能是一种环境友好的储粮防虫方式。

三、关键技术与方法

研究人员采用了以下几项关键技术方法：植物材料于突尼斯杰尔巴岛南部采集，经水蒸气蒸馏（Clevenger装置，4小时）提取挥发油，并通过气相色谱-质谱-火焰离子化检测（GC-MS-FID）结合HP-5毛细管柱分析其化学成分。抗氧化活性采用ABTS自由基阳离子清除法评估，以抗坏血酸为标准对照。杀虫活性包括滤纸偏好区法驱避试验和熏蒸毒性试验，以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）成虫为试虫。细胞毒性评估使用SAF-1细胞系（RRID: CVCL_4295，ECACC编号00122301），采用MTT比色法测定细胞活力。抗脂氧合酶活性以亚油酸为底物、大豆脂氧合酶为酶源进行测定，地塞米松为阳性对照。分子对接采用AutoDock 4.2程序包，以5-脂氧合酶晶体结构（PDB: 3v99）为受体靶标。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey多重比较检验，显著性水平设为p < 0.05。

四、研究结果

4.1 M. marina挥发油的化学成分

如先前报道所述，突尼斯M. marina挥发油富含单萜类（如β-紫罗酮）和倍半萜类（如α-葎草烯），酚类化合物（如丁香油酚和甲基丁香油酚）以及类胡萝卜素衍生物（如(E)-β-大马士酮）也较为丰富。其主要成分为(E)-β-紫罗酮（17.677%）、甲基丁香油酚（10.759%）和丁香油酚（8.86%）。化学类别分析显示，酮类单萜占23.224%，酚类占21.377%，醛类占13.702%，烃类占9.925%，倍半萜类占9.515%。影响挥发油化学成分的因素包括植物物种、所用植物材料部位、气候类型、地理位置和采收时间等。

4.2 M. marina挥发油的抗氧化活性

通过ABTS法评估总抗氧化能力，结果显示M. marina挥发油具有显著的剂量依赖性抗氧化效应（p < 0.05）。在5 mg/mL浓度下，抗坏血酸当量（AAE）值约为3.61 ± 0.4 mg/mL，IC₅₀值为1.7 ± 0.4 mg mL^?1。虽然与纯维生素C标准品（IC₅₀ = 1.24 ± 0.33 mg/mL）存在统计学差异，但这一较小差异凸显了该粗挥发油基质有效的内在供氢或电子转移能力。挥发油的抗氧化特性并非由单一成分决定，而是由所有成分间的相互作用决定，可能产生拮抗或协同效应。以丁香油酚和甲基丁香油酚为主要成分的挥发油与强抗氧化活性相关联。

4.3 M. marina挥发油的杀虫活性

4.3.1 驱避效应： 在2 mg/mL浓度下，M. marina挥发油暴露1小时后对赤拟谷盗表现出显著的驱避活性，驱避率（PR）为70.7% ± 1（Class IV级），而对照组为79.16%（p < 0.05）。相比之下，同属豆科的葫芦巴挥发油驱避效果较弱（33.70%，Class II级）。挥发油的驱避特性主要与单萜类和倍半萜类化合物相关。大多数驱虫化合物为含氧化的化合物，其羟基连接在伯碳、仲碳或芳香碳上。酚类化合物（如丁香油酚、百里酚和香芹酚）在精油中的存在与增强的杀虫和驱避性能密切相关，其作用机制包括阻断章鱼胺受体、干扰GABA门控氯离子通道以及在昆虫细胞中引起氧化应激。值得注意的是，丁香油酚对四种甲虫物种表现出80%–100%的驱避率。

4.3.2 熏蒸活性： 在评估的实验条件下，暴露于M. marina挥发油的赤拟谷盗未出现死亡，表明在所测浓度下该挥发油对此物种无明显的熏蒸杀虫效果。生物活性化合物可能不会直接杀死昆虫，但可能引起产卵量急剧下降和各种发育异常，从而完全阻止个体发育。研究人员建议开展产卵抑制试验、发育影响研究或长期暴露实验，以评估该挥发油对赤拟谷盗种群的亚致死效应。

4.4 M. marina挥发油对SAF-1细胞的细胞毒性活性

在0.005至5 mg mL^?1的浓度范围内评估挥发油对SAF-1细胞的潜在细胞毒性效应。结果表明，当挥发油浓度低于5 mg mL^?1时，对细胞活力无统计学显著影响。然而，在最高浓度（5 mg mL^?1）下，M. marina挥发油导致63.2%的细胞死亡，EC₅₀ = 4.088 mg mL^?1。高浓度的丁香油酚表现出细胞毒性，直接接触含丁香油酚的材料可能导致组织损伤。甲基丁香油酚在10至500 mM浓度范围内可诱导啮齿动物非程序性DNA合成（UDS）。(E)-β-紫罗酮衍生的查尔酮对癌细胞表现出细胞毒性效应，诱导凋亡信号并通过将细胞阻滞于G0期来抑制细胞生长。细胞毒性发现为挥发油的杀虫和抗氧化特性提供了重要补充，提供了关于生物安全性和对非靶细胞潜在影响的信息。

4.5 抗脂氧合酶抑制试验

M. marina挥发油表现出统计学上显著的抗脂氧合酶活性，IC₅₀ = 0.01 ± 0.002 μg mL^?1，而地塞米松对照的IC₅₀ = 0.005 ± 0.001 μg mL^?1。在0.08 μg/mL浓度下，该挥发油诱导了75.21%的酶抑制，且活性呈显著剂量依赖性（p < 0.05）。酶动力学实验表明，丁香油酚通过非竞争性机制抑制脂质过氧化，改变最大速度而保持米氏常数不变。丁香油酚还通过非竞争性机制抑制5-脂氧合酶（5-LO），并在脂多糖刺激的鼠巨噬细胞中表现出COX-2抑制活性。精油中发现的酚类化合物具有强抗炎特性，特别是调节花生四烯酸通路中的重要酶。抑制5-脂氧合酶可减少促炎性白三烯的产生。天然酚类（如丁香油酚、百里酚等苯丙素衍生物）已被证明能抑制脂质过氧化并干扰炎症性酶促氧化过程。

4.6 分子对接分析

分子对接研究以5-脂氧合酶靶受体（pdb: 3v99）为模型，评估挥发油五种主要植物成分的结合亲和力。LOX-5的结合位点主要由约50%的疏水性氨基酸组成（Trp147, Phe169, Phe177, Leu179, Phe229, Leu368, Ile406, Ala410, Phe555, Ala603, Leu607, Phe610, Val671和Ala672）。对接结果显示，各配体表现出可观的结合亲和力，范围从?4.2至?5.7 kcal/mol，但均未超过地塞米松标准品的对接分数（?7.4 kcal/mol）。其中，α-葎草烯和(E)-β-紫罗酮表现出最佳的对接分数（结合能值均为?5.7 kcal/mol），(E)-β-大马士酮为?5.2 kcal/mol，而丁香油酚（?4.5 kcal/mol）和甲基丁香油酚（?4.2 kcal/mol）结合亲和力较弱。α-葎草烯与Phe177、His372、Ile406、Lys409、Ala410和Leu607形成多个烷基/π-烷基疏水相互作用；(E)-β-紫罗酮与His367形成碳氢键、与His372形成π-σ键以及与Phe177、Ile406和Ala410形成烷基/π-烷基接触。这些发现提示五种主要植物分子具有抑制LOX-5的显著潜力，但分子对接仅提供靶蛋白与所发现化合物之间潜在相互作用的理论预测，所建议的相互作用应视为需要进一步验证的假说。

五、讨论总结与结论翻译

讨论总结： 研究结果表明，M. marina挥发油具有广泛的生物活性，包括杀虫、抗氧化、抗脂氧合酶和细胞毒性活性。这些活性应被视为化学复杂混合物生物潜力的互补要素，而非独立特征。杀虫活性强调了其在害虫管理中的潜在相关性，抗氧化和抗脂氧合酶活性则提示与氧化过程和脂质代谢相关的潜在功能。另一方面，鱼成纤维细胞中观察到的细胞毒性凸显了评估选择性和对非靶生物潜在影响的重要性。因此，需要进一步的机制性、体内和应用导向研究来确定该挥发油的实际价值，其潜在应用应结合其已证实的活性和安全性特征进行综合评估。

结论翻译： 总之，本研究的结果阐明了M. marina挥发油的多方面特性，包括其抗氧化、杀虫和抗脂氧合酶活性，并通过计算机模拟分子对接分析进一步支持，该分析预测了主要植物化学物质相对于参考化合物对酶活性位点的有利结合亲和力。这些发现将有助于指导未来关于挥发油作为鱼饲料添加剂的应用研究，例如该挥发油在食品包装中用于阻止干粮储存中昆虫的潜在用途。需要进一步研究来确定这些生物活性化合物在药理学和农业领域的潜在应用。