《Environmental DNA》：Complementary but Not Interchangeable: A Comparison of eDNA and Bulk Sample Metabarcoding for the Assessment of Groundwater Invertebrate Communities
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地下水无脊椎动物具有高度的生物多样性，可靠的评估对于地下水生态系统的保护和饮用水质量的维持至关重要。分子方法正越来越多地用于表征地下生物多样性，但水来源的环境DNA（eDNA）与批量样本宏条形码在多大程度上能够恢复可比的多样性和群落组成模式，目前仍不清楚。为此
地下水无脊椎动物具有高度的生物多样性，可靠的评估对于地下水生态系统的保护和饮用水质量的维持至关重要。分子方法正越来越多地用于表征地下生物多样性，但水来源的环境DNA（eDNA）与批量样本宏条形码在多大程度上能够恢复可比的多样性和群落组成模式，目前仍不清楚。为此，研究人员在50个采样点评估了两种方法在多个分类水平（包括操作分类单元（OTU）、门和物种）上对地下水无脊椎动物群落评估的一致性与互补性，并特别关注地下水生动物区系（stygofauna）以及地下水生动物（stygobiont）与非地下水生动物（non-stygobiont）物种的区分。此外，研究人员还通过比较泉水和消防栓（两种方法均应用于同一介质）与地下水监测井（GMW，其中钻孔与含水层样本在空间上分离），考察了采样情境对群落特征的影响。总体而言，两种方法恢复的水生无脊椎动物群落结构存在显著差异，分类重叠有限，并产生了各自独特的方法特异性模式。甲壳类物种通过批量样本宏条形码恢复更为有效，而较小和软体类群则通过eDNA宏条形码检测效果更佳。在总体检测到的54个水生物种中，22个被归类为地下水生动物（stygobionts），其中100%由批量样本宏条形码恢复，而eDNA仅检测到50%。钻孔与含水层群落之间的差异在很大程度上被eDNA与批量样本宏条形码之间的方法学差异所掩盖。这些发现表明，两种方法具有互补性而非互换性，并强调在评估地下水生物多样性和解读钻孔-含水层关系时，必须考虑方法学效应。
论文解读
一、研究背景与科学问题
地下水无脊椎动物栖息于地球上最大的液态淡水储层之中，统称为地下水生动物区系（stygofauna），其中包括严格适应并局限于地下水生境的地下水生动物（stygobionts），以及偏好或偶尔进入地下水的非地下水生动物（non-stygobionts，包括地下好栖种stygophiles和地下偶栖种stygoxenes）。这些生物在维持地下水质量等生态系统服务方面发挥着重要作用，例如通过增强微生物碳降解来保障饮用水的可靠供给。然而，由于不可持续利用、污染和气候变化等 anthropogenic 压力，地下水资源正面临广泛衰退，而地下水生物群落的研究和保护仍然不足。
传统上，地下水生动物物种的鉴定依赖于形态学特征，这一过程耗时且高度依赖分类学专家的专业知识。近年来，分子方法日益被用于地下生态系统的生物多样性评估。DNA宏条形码（DNA metabarcoding）技术将短遗传标记区域的扩增与高通量测序相结合，以确定生态系统内整个群落的多样性。常用的无脊椎动物检测标记包括18S核糖体RNA基因和线粒体细胞色素c氧化酶I（COI）基因。用于宏条形码研究的DNA可来自批量样本（从目标生物组织提取）或环境DNA（eDNA，直接从水、沉积物或空气等环境样本中提取）。两种方法各有优势：批量宏条形码在指示类群的可靠检测和高分类分辨率方面具有优势；eDNA采样则无需生物分拣、非侵入性且对敏感地下水生境干扰最小。
然而，此前对批量样本与eDNA宏条形码的直接比较仅在地表水生态系统中开展，地下环境中的系统比较仍然缺乏。此外，地下水群落监测因采样通道受限而更加复杂，通常只能通过钻孔进行，且普遍假设钻孔群落与周围含水层群落一致，但这一假设尚未得到充分验证。因此，本研究旨在系统比较两种方法在地下水无脊椎动物多样性评估中的一致性和互补性，并考察不同采样情境（同一介质vs.空间分离介质）对方法间重叠度的影响。
二、研究设计与方法概述
研究区域位于德国巴登-符腾堡州，共从50个采样点采集批量样本和eDNA水样，包括33个地下水监测井（GMW）、12个泉水或泉集水箱以及5个连接弗莱堡饮用水供水系统的消防栓。批量样本使用63 μm网孔采样器采集；eDNA样本使用潜水泵采集50 L水样并经0.22 μm滤膜过滤。两种方法均使用fwhF2—fwhR2n引物对靶向COI区域。生物信息学处理采用JAMP流程，以97%相似度聚类为操作分类单元（OTU），通过BOLD v5数据库进行分类注释，物种水平相似度阈值≥98%、属水平≥95%、科水平≥90%。统计分析使用R软件，包括NMDS排序、PERMANOVA和Kruskal-Wallis检验等。
三、研究结果
3.1 基于eDNA和批量样本宏条形码的地下水无脊椎动物群落组成
批量样本中OTU以节肢动物门（Arthropoda）为主（67.6%），其次为环节动物门（Annelida，14.2%）；eDNA样本中节肢动物仍占多数但比例较低（40.1%），其后依次为环节动物（13.4%）、软体动物（11.7%）、线虫动物（10.7%）、轮虫动物（9.8%）、纽形动物（7.5%）、刺胞动物（4.2%）和多孔动物（2.6%）。在OTU水平上，54.6%仅由eDNA检测到，31.6%仅由批量样本检测到，仅13.8%为两种方法共有。共鉴定出54个水生无脊椎动物物种，其中22个（40.7%）仅由批量样本检测，12个（22.2%）仅由eDNA检测，20个（37.0%）为两种方法共同检测。22个物种被归类为地下水生动物（stygobionts），批量样本恢复了全部22个（100%），而eDNA仅检测到50%；非地下水生动物（non-stygobionts）物种两种方法的检出比例相近（批量62.5%，eDNA 65.6%）。值得注意的是，所有仅由eDNA检测到的物种均为非地下水生动物。
3.2 不同采样方式下的群落相似性
NMDS排序显示群落组成按采样方法明显分离，同一采样点经两种方法分析得到的群落并未在排序空间中紧密关联，而同一方法分析的群落彼此更为相似。在GMW和泉水样本中，批量与eDNA样本的群落组成差异显著（PERMANOVA，GMW：R2=0.100，p=0.0001；泉水：R2=0.113，p=0.001）；消防栓样本中方法解释的变异比例较大（R2=0.320）但未达显著水平（p=0.0625），可能与样本对数量较少（n=5）有关。配对样本的Jaccard相异度在所有栖息地类型中均较高（中位数：消防栓0.89、泉水0.96、GMW 0.97），且不同栖息地类型间无显著差异（Kruskal-Wallis检验，p=0.2007），表明即使在同一介质中采样，两种方法的重叠度仍然很低。
四、讨论与结论
讨论部分指出，两种方法在OTU水平上检测到的无脊椎动物比例存在显著差异，eDNA样本中非靶标OTU比例较高（65.7%），这可能源于过滤采样捕获了水体中包括藻类、细菌和真菌在内的全部DNA，加之COI引物的简并性以及eDNA样本较高的PCR循环数导致的扩增偏好。在物种水平上，批量样本更有效地恢复了甲壳类物种，而eDNA则更好地检测了小型和软体类群，如线虫、轮虫、纽形动物和多孔动物。eDNA独有的物种全部为非地下水生动物，这与地下水生动物（stygobionts）以甲壳类为主、而软体类群多为非专性地下物种的分类组成特征一致。
钻孔与含水层群落之间的潜在生态差异在很大程度上被方法学差异所掩盖。即使在泉水和消防栓（两种方法针对同一介质）中，方法间的相异度也与GMW（钻孔与含水层空间分离）相当，表明方法学偏差足够强，足以掩盖生态差异。研究还讨论了eDNA宏条形码的挑战，包括过滤水量受浊度限制、PCR抑制物、参考数据库不完整等问题，并提出了被动eDNA采样、增加重复数和扩充参考数据库等改进建议。
研究结论指出：第一，两种方法具有互补性而非互换性，组合使用可提供最全面的地下水无脊椎动物多样性评估，而当甲壳类为主要目标类群时，批量采样是更优选择；第二，钻孔与含水层群落之间的潜在差异被方法学差异所掩盖，在评估地下水生物多样性和解读钻孔-含水层关系时，必须考虑方法学效应。
