《Environmental Microbiology Reports》：Diagnosing Anaerobic Digesters' Function and Performance: From Meta-Omics to Integrated Meta-Omics Analyses
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厌氧消化（Anaerobic Digestion, AD）是将有机废弃物通过微生物转化为生物甲烷的过程，对生物能源生产具有重要贡献。然而，由于其复杂的微生物生态、动态的生化途径以及对扰动的敏感性，该生物过程仍面临诸多挑战。过去十年间，利用宏分类组学（metat
厌氧消化（Anaerobic Digestion, AD）是将有机废弃物通过微生物转化为生物甲烷的过程，对生物能源生产具有重要贡献。然而，由于其复杂的微生物生态、动态的生化途径以及对扰动的敏感性，该生物过程仍面临诸多挑战。过去十年间，利用宏分类组学（metataxonomics）、宏基因组学（metagenomics）、宏转录组学（metatranscriptomics）、宏蛋白质组学（metaproteomics）和代谢组学（metabolomics）等宏组学（meta-omics）方法诊断其功能已成为必要且普遍的手段。然而，单一宏组学方法仅能提供对该生物过程有限的生物学认知。这促使多种宏组学方法被串联使用；但多数研究仍将各宏组学数据分别检验与解读，限制了其在分子层面揭示功能交互的能力。当前前沿方向为整合宏组学（integrated meta-omics），即将多种宏组学数据与过程数据系统性地整合为一个可解释的统一系统，以实现对AD的机制性理解、诊断与预测性控制。本综述批判性地审视了宏组学在AD中的具体应用，讨论了其优势、局限性以及在整合宏组学方法中的独特定位。重要的是，本文探讨了整合宏组学的计算框架、方法论与挑战。通过跨组学验证，发现具有高预测力且在AD系统间可转移的诊断生物标志物被重点强调。随着工作流程的标准化与技术的成熟，整合宏组学将为AD生物过程在生物能源领域的进步作出重要贡献。
1 引言
厌氧消化（AD）作为生物能源生产与废弃物资源化的重要生物过程，对碳中和与循环经济具有贡献。AD是由复杂微生物网络将有机废弃物在厌氧条件下降解为富含营养的消化液和可升级为生物甲烷的沼气。然而，AD是一个高度结构化且动态的生物过程，其复杂的微生物、生化、互养（syntrophic）交互与理化过程相互交织，使该过程成为对扰动高度敏感且易失效的生物学“黑箱”。传统上，pH、温度、沼气/甲烷产量、氨氮和挥发性脂肪酸（VFAs）浓度、化学需氧量（COD）等理化指标被用于跟踪、控制和优化厌氧消化器运行。但这些指标往往是微生物活动的终点，只能在失稳发生后指示问题。微生物是AD生物过程的支柱，理解其动态、功能交互及交互结果至关重要。近年来，研究AD复杂微生物生态及其与运行条件相互作用已成为理解并改善AD生物过程设计、效率与稳定性的重要途径。这一途径因宏组学领域的巨大发展而快速推进，使研究者能够在分子分辨率下理解AD微生物组与生物过程。过去十年，宏组学已实现在微生物组成、功能与活性层面表征AD生物过程。单一宏组学方法可提供有限的生物学理解，多宏组学串联分析则可在多个分子层面研究该过程，提供更广泛或更深入的覆盖。当前领域正转向整合宏组学，即将多个宏组学层与理化及运行数据系统性地整合为一个可解释的统一系统，以揭示连接分子事件与消化器性能结果之间的因果链。
2 宏组学在AD生物过程中的应用
宏组学使研究者无需繁琐且不现实的培养技术即可研究AD微生物组。目前，AD生物过程研究中较大比例的研究采用单一宏组学方法，但单一宏组学仅提供AD功能的部分快照。宏基因组学识别基因但无法确认其是否表达；宏转录组学揭示表达但不反映蛋白质活性；宏蛋白质组学展示功能蛋白但不反映代谢通量；代谢组学捕获生化结果但不揭示其微生物来源。多数单宏组学和多宏组学研究仍主要依赖DNA分析，包括标记基因分析（宏分类组学）或全基因组分析（宏基因组学）。宏分类组学（16S rRNA扩增子测序）仍是分析AD生物过程中细菌和古菌群落的主要方法，尽管其仅限于分类学信息且分辨率有限。宏组学信号只有在与有机负荷率（OLR）、水力停留时间（HRT）、温度、pH、碱度、氨氮、VFA谱和沼气组成等消化器条件相关联时才获得功能意义。将宏组学层与生物过程数据关联，可识别微生物响应与性能结果之间的潜在关系，揭示基因表达、酶产生或代谢物积累的变化如何对应抑制事件、途径转换或生物甲烷产量变化。
2.1 通过宏组学理解AD
AD包含四个顺序步骤：水解、产酸、产乙酸和产甲烷，各阶段由独特的功能微生物群介导并紧密耦合。宏分类组学和宏基因组学已帮助表征水解细菌、发酵菌、互养产乙酸菌和产甲烷菌的宏基因组库，揭示群落结构、多样性和功能潜力。核心微生物群指在正常运行厌氧消化器中一致存在的微生物类群，使AD成为结构化代谢过程的平衡生态环境。水解细菌在水解阶段分泌胞外酶，将碳水化合物、蛋白质和脂类等有机聚合物转化为可溶性单体。产酸菌在发酵过程中产生VFAs、氢气、二氧化碳、氨等中间产物。此后，产乙酸菌将有机酸转化为乙酸、二氧化碳和氢气供产甲烷使用。产甲烷菌是古菌，可从乙酸、二氧化碳加氢气或甲基化合物产生甲烷，分为乙酸营养型、氢营养型和甲基营养型。然而，宏基因组丰度并不直接意味着基因表达或微生物活性。例如，产乙酸阶段是最受热力学限制的阶段，依赖互养细菌，其活性无法仅从群落组成推断。宏转录组学通过捕获实时基因表达模式帮助识别消化器中的活性微生物群和功能，揭示微生物群体如何动态调控水解、发酵、β-氧化、互养乙酸氧化（SAO）和产甲烷以响应运行和环境压力。宏蛋白质组学通过识别实际部署的功能蛋白和酶增加功能层，将转录信号与催化能力和途径执行联系起来。代谢组学通过检测和定量LCFAs、脂类、甾醇、酚类、氨基酸、多糖、嘌呤、核苷酸及复杂微生物代谢物，以及其β-氧化中间体、TCA衍生发酵中间体、VFAs、氧化还原辅因子和应激响应代谢物，捕获分子过程的生化结果。
2.2 非细菌和非古菌微生物群的新兴作用
AD研究历史上聚焦于细菌和古菌，但病毒、真菌和原生动物代表了AD微生物群中大量但研究不足的部分。病毒群落，特别是噬菌体和古菌病毒，通过“杀灭优胜者”动力学塑造微生物更替，调节互养和产甲烷种群，并促进水平基因转移。宏分类组学、宏基因组学和宏转录组学越来越多地检测到裂解性和溶原性病毒的存在，以及在氨或LCFA胁迫期间的病毒复制。厌氧真菌，特别是Neocallimastigomycota成员，贡献强效碳水化合物活性酶，增强木质纤维素底物的水解。宏组学方法已开始揭示真菌CAZyme基因簇、活性纤维素酶和木聚糖酶表达以及糖苷水解酶蛋白。原生动物在捕食、氢代谢和与产甲烷菌共生方面发挥作用。宏基因组学和宏转录组学在瘤胃等类似厌氧系统中检测到氢化酶体基因和活性原生动物代谢，代谢组学揭示原生动物驱动的氢和VFA谱变化。这些新兴见解强调需要将病毒、真菌和原生动物纳入AD生态的系统级模型。
2.3 通过宏组学追踪抑制与失稳
AD生物过程极易受到氨、硫化氢和重金属等抑制剂的影响。氨抑制是AD生物过程中最普遍且运行上最重要的挑战之一。总氨氮（TAN）包括游离氨氮（FAN）、NH3（非离子化形式）和NH4+（离子化形式），FAN被认为是主要抑制剂且毒性最强。氨抑制主要影响产甲烷过程。宏分类组学和宏基因组学提供基线，识别对氨最敏感的产甲烷菌群，特别是Methanosaeta等乙酸营养型类群，并揭示在高氨条件下常占优势的互养乙酸氧化细菌（SAOB）。宏转录组学通过检测乙酸营养型产甲烷基因下调以及氢营养途径、应激响应基因和铵转运蛋白的上调来呈现氨抑制，这些变化往往发生在生物甲烷产量下降之前。宏蛋白质组学谱通常显示关键乙酸营养酶丰度降低，同时氢化酶、甲酸脱氢酶和SAO相关β-氧化酶表达增加。最终，代谢组学显示这些分子变化的后果，包括丙酮酸、乙酸、黄嘌呤、丙氨酸、琥珀酸、支链VFA（异丁酸、异戊酸）、乳酸、辅因子等关键代谢物积累，表明电子流阻塞、碳通量转向还原性终产物、互养氧化受损和产甲烷抑制。
硫化物抑制主要源于硫酸盐还原和含硫氨基酸降解。升高的硫化物浓度通过破坏酶功能、损伤含金属辅因子、抑制电子传递和沉淀必需微量金属（如Fe、Ni）对细菌和古菌产生毒性。硫酸盐还原菌（SRB）如Desulfovibrio、Desulfotomaculum和Desulfobulbus与产甲烷菌竞争底物和电子供体。宏蛋白质组学谱通常显示Ni-Fe氢化酶、甲酰甲烷呋喃脱氢酶和辅酶M还原酶复合物丰度降低，同时SRB相关蛋白丰度增加，直接提供硫化物驱动电子流和代谢竞争变化的证据。
LCFAs是脂类水解产生的重要代谢物，需专门的β-氧化细菌降解。LCFA积累可源于其产生增加或降解速率降低，表明功能失调。LCFA积累抑制互养菌和产甲烷菌，导致污泥起泡、微生物群落结构破坏和运行失稳。
温度波动方面，运行温度是塑造微生物群、功能途径、生物甲烷产量和生物过程稳定性的重要因素。宏组学研究已阐明温度波动期间的微生物群落结构和功能。稳定性与灵活性需通过将功能分析（宏蛋白质组学和宏转录组学）纳入分类学谱系来更好地理解，揭示AD微生物群中独特的功能冗余，即不同微生物群在不同温度下执行相同功能。
2.4 通过宏组学评估优化过程中的AD生物过程性能
多年来，改善AD生物过程效率和韧性的努力包括消化器重新设计、预处理、共消化、微量营养素补充、碳基材料添加等。宏组学为重新设计消化器提供了机制基础，揭示结构和运行变化如何影响微生物群体和代谢通量。例如，温度分级与生物分相（TSBP）生物消化器和厌氧迷宫流生物反应器（AL-FB）的设计均通过宏基因组学和功能酶注释识别水解、发酵、互养和产甲烷途径的功能变化。预处理方面，宏基因组学和宏分类组学显示热水解污泥降解导致微生物多样性显著降低并塑造核心功能群体；生物学预处理后Methanosaeta活性增加5倍，显著增强生物甲烷产量。共消化策略通过宏组学实现合理选择底物组合，补充营养缺陷。微量营养素补充方面，宏分类组学和宏蛋白质组学确认了在微量元素缺乏期间从乙酸营养型向氢营养型产甲烷的转变。碳基材料如沸石、生物炭和水热炭的添加可通过吸附抑制氨胁迫、促进选择性微生物定殖和直接种间电子传递。宏基因组学分析显示水热炭添加在氨抑制下主要提高氢营养型产甲烷菌多样性，代谢组学则显示从氢营养型产甲烷向甲基营养型和甲醇型产甲烷途径的转变，最终提高甲烷产量。
3 AD生物过程的整合宏组学策略
整合宏组学将每个宏组学数据集视为一个数据块，通过建立块间连接来建模相互关系。多组学数据集的复杂性和异质性带来技术和计算挑战，阻碍生物学解释和模型交叉验证。开发整合宏组学方法需要精心设计研究方案、选择适当的宏组学方法、数据和元数据收集、统计和计算考量。从同一份样品同时收集DNA、RNA、蛋白质和代谢物对促进直接跨组学比较至关重要。采样间隔、频率和持续时间以及对照和重复的设置均对研究准确性和可重复性至关重要。
数据预处理方面，由于宏组学产生不同格式、大小、分辨率、单位、尺度、时间尺度、样本数、噪声水平和维数的异质数据集，每个数据集在整合前应分别预处理。预处理包括空白扣除、缺失值移除或插补、批次效应校正和离群值移除。数据归一化、变换、中心化、缩放和格式化也是必要步骤。
降维方面，特征提取通过将原始特征转换为新的合成特征来降低维度，但可能丧失生物学可解释性；特征选择通过保留最非冗余和重要的特征来降低维度，保持可解释性并减少过拟合。特征选择分为过滤式、嵌入式（如Lasso、随机森林、XGBOOST）和包装式三类。R包mixOmics是适用于单组学和多组学数据集降维的多块工具箱。
当前数据整合方法方面，整合框架从线性潜变量模型到概率框架、网络方法、张量方法和深度学习架构。DIABLO是基于稀疏PLS的监督多块方法，擅长识别与表型相关的跨组学生物标志物。MOFA+是基于贝叶斯因子分析的无监督方法，可处理缺失数据并发现共享/特异因子。ComDim或CCSWA提供高度可解释的多块分解和明确的块贡献。TimeOmics和TensorOmics处理纵向和多因素实验设计。深度学习方法如变分自编码器（VAEs）、多核学习（MKL）和深度典型相关分析（DCCA）适用于非线性AD动态，但需要大数据集和仔细正则化。虽然PLS/O2PLS、CCA、NMF、WGCNA、图整合和张量分解已广泛用于AD，但DIABLO、MOFA+、ComDim/CCSWA、TimeOmics、TensorOmics、多模态VAE、DCCA、MKL、iClusterPlus和JIVE/AJIVE等方法尚未被广泛应用。
整合方法方面，高层次/晚期整合仅组合各宏组学数据块模型的结果，灵活但丢失底层交互；中层次/中间整合先对各数据集进行特征提取和/或选择再融合，结合知识驱动和数据驱动方法；低层次/早期整合先将数据块拼接为多块再共同处理和分析，保留底层交互但增加维度，需进行多块预处理如块方差缩放或块秩缩放。ComDim/CCSWA是适合低层次宏组学整合的框架。
3.3 整合宏组学分析在生物标志物发现中的应用
AD中的整合宏组学生物标志物发现仍处于新兴阶段。AD研究常依赖单一宏组学生物标志物，其可重复性足以使用，但预测力和跨AD系统转移性有限。整合宏组学方法通过提供多组学视角发现更稳健的生物标志物。稳健的AD生物标志物应可靠反映特定抑制机制或功能转变，具有跨组学一致性验证；须对特定微生物群体或途径具有强特异性，对氨、硫化物、LCFA过载、有机或温度冲击等运行压力源具有高灵敏度；必须可量化且具有明确机制相关性，变化直接反映生化瓶颈或抑制事件；最后须对性能下降前的抑制或失稳早期检测和诊断具有强预测价值。
4 结论
宏组学仍是理解、诊断和改进AD生物过程的重要工具。然而，没有任何单一宏组学方法足以全面分析AD生物过程。多宏组学方法提供了更有价值的信息和见解，当前焦点转向整合各宏组学平台产生的数据集或结果以进行全面分析和解释。宏组学整合将推进对AD生物过程中复杂微生物组交互的现有理解。挑战包括管理多宏组学研究及相关下游计算分析的成本，处理宏组学数据集的复杂性和异质性，以及开发易于使用的计算和统计工具和方法以组合和分析宏组学数据集、模型和结果。这将进一步加速AD生物过程在可持续能源生产和生物经济方面的发展。
