人类肠道单细胞染色质可及性图谱解析克罗恩病调控程序与遗传风险

《Nature Genetics》：Single-cell analysis of chromatin accessibility in the human intestine identifies regulatory programs and clarifies genetic associations in Crohn’s disease

　　

克罗恩病（Crohn's disease）是一种复杂的炎症性肠病，由遗传、微生物和环境因素的相互作用所致。细胞类型特异性的克罗恩病病因学及遗传风险贡献尚未被完全阐明。研究人员构建了一个细胞类型分辨的染色质可及性综合图谱，包含来自23例活动期和非活动期克罗恩病患者及16例健康对照的回肠末端和升结肠的557,310个候选顺式调控元件（candidate cis-regulatory elements，cCREs）。研究人员识别了细胞类型特异性、解剖位置特异性和上下文特异性cCREs，并表征了克罗恩病患者肠黏膜炎症反应背后的调控程序。这些细胞类型分辨的数据证实，克罗恩病遗传力主要在适应性免疫细胞（尤其是T细胞）以及包括中性粒细胞在内的固有免疫细胞中富集。利用精细定位的非编码克罗恩病变异，研究人员识别了30个位于cCREs内的变异。该图谱为研究克罗恩病和健康状态下的基因调控效应提供了综合性资源，并凸显了克罗恩病风险背后的细胞复杂性。

克罗恩病（Crohn's disease，CD）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的主要亚型之一，表现为胃肠道的慢性进行性炎症，其发病机制涉及宿主遗传、肠道微生物群及环境因素的复杂相互作用。全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）已鉴定超过320个与IBD风险相关的遗传位点，然而由于肠道黏膜包含上皮、免疫和间质等多种谱系的数十种细胞类型，不同细胞类型在疾病遗传易感性及炎症应答中的特异性贡献仍不清楚。单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）虽能解析转录组变化，却无法直接捕获开放染色质所定义的活跃调控元件。为此，研究人员利用单细胞转座酶可及性染色质测序（single-cell assay for transposase-accessible chromatin using sequencing，scATAC-seq），系统描绘了人类肠道黏膜的细胞类型分辨染色质可及性图谱，旨在阐明CD相关调控程序并精细解读非编码遗传变异的功能。

研究共纳入23例活动期或非活动期CD患者和16例健康对照，采集回肠末端（terminal ileum，TI）和升结肠（ascending colon，AC）共71份内镜活检样本。经过质量控制，保留178,030个细胞，采用ArchR流程聚类并借助匹配的scRNA-seq数据进行注释，共识别29个细胞类型簇，涵盖上皮、免疫和间质三大谱系。在此基础上，研究人员对每个细胞类型分别进行峰识别，合并获得包含557,310个候选顺式调控元件（candidate cis-regulatory elements，cCREs）的联合峰集。这些cCREs大多位于内含子（52.9%）和远端基因间区（33.9%），其中79%与既往肠道多组学参考图谱重叠。通过主题模型（topic modeling）分析，研究人员进一步识别了细胞类型特异性、谱系共享以及炎症上下文特异性的调控程序；结合差异可及性分析（differentially accessible regions，DARs）、染色质可及性数量性状位点（chromatin accessibility QTLs，caQTLs）定位、分层连锁不平衡评分回归（stratified LD score regression，sLDSC）以及统计精细映射（fine-mapping）等手段，系统解析了CD遗传风险的细胞类型来源与非编码变异的功能后果。

主要技术方法上，研究人员采用了以下核心策略：样本队列来自美国芝加哥大学收集的CD患者与健康对照的TI/AC内镜活检（23例CD，16例对照）；使用scATAC-seq获取单细胞开放染色质图谱，以ArchR完成聚类与注释，以MACS2进行峰识别；应用fastTopics拟合主题模型，识别共享和上下文特异的调控程序；通过GLIMPSE2/Eagle从scATAC-seq读数中推断个体基因型，使用RASQUAL在各细胞类型中定位caQTLs；利用sLDSC评估IBD遗传力的细胞类型特异性富集；采用SuSiE对CD GWAS信号进行精细映射，并将高后验包含概率（posterior inclusion probability，PIP）变异叠加至细胞类型分辨cCREs进行功能注释。

结果部分：

（1）肠黏膜的调控图谱：研究人员通过scATAC-seq构建了人类肠道黏膜细胞类型分辨染色质可及性图谱，鉴定29个细胞类型簇。上皮细胞占比最高（69.3%），其次为免疫细胞（26.3%）和间质细胞（4.3%）。值得注意的是，图谱捕获了中性粒细胞，该群细胞在scRNA-seq中通常难以分离。基于各细胞类型簇的峰识别获得557,310个cCREs，其中大多数位于内含子和远端基因间区，而启动子及近启动子区域的cCREs在更多细胞类型间共享。该图谱覆盖了上皮、免疫和间质谱系的所有主要细胞类型，为后续调控程序分析奠定了基础。

（2）肠黏膜cCREs的特征描述：为捕捉连续分化过程、跨细胞类型共享过程和炎症等上下文特异信号，研究人员采用主题模型对染色质可及性矩阵进行无监督分解，选择主题数K=45。主题模型识别出细胞类型特异主题（如topic 5对应回肠杯状细胞）、谱系共享主题（如topic 18富集于树突状细胞和巨噬细胞，富集SPI1和IRF4基序）以及全细胞共享主题（如topic 2富集CTCF基序）。该方法补充了基于聚类的离散注释，能够更完整地描述黏膜中动态的基因调控程序。

（3）上皮细胞中与炎症相关的染色质可及性：炎症是CD的核心病理特征。研究人员发现topic 7在活动性炎症活检来源的上皮细胞中显著富集，其cCREs富集AP-1家族成员（FOSL1/FOSL2）和干扰素调节因子（IRF2/IRF3/IRF9）的基序，目标基因包括LCN2、NOS2、DUOX2、DMBT1、REG1A/REG1B及主要组织相容性复合体II类（MHC-II）编码基因。topic 9则特异富集于炎症样本的间质细胞，特别是升结肠成纤维细胞。进一步对21种细胞类型进行差异可及性分析，发现上皮细胞贡献了最多的炎症相关DARs（iDARs）。不同细胞类型的iDARs富集了不同的转录因子基序，如早期肠细胞富集SOX4、FOXA、GATA因子，CD8⁺ T细胞富集EOMES，浆细胞富集POU2F2，巨噬细胞富集FOSL/IRF/STAT2及CEBP/SPI1。以上结果揭示了炎症过程中细胞类型特异的转录调控程序。

（4）TF结合基序的破坏影响染色质可及性：为将遗传变异与染色质可及性直接关联，研究人员利用39例个体的基因型数据在19个细胞类型中定位caQTLs，每个细胞类型检测到21至8,533个caQTLs。caQTLs富集于启动子和峰中心区域。通过比较caQTL效应量与TF基序破坏分数，64个TF基序在至少一个细胞类型中显示出显著相关性，表明关键谱系特异性TF结合基序的破坏与染色质可及性降低相关，例如浆细胞中的TCF3和结肠细胞中的CDX2；肠细胞中IRF9和IRF3的显著相关性进一步支持IRF在肠细胞调控中的作用。这些分析验证了细胞类型特异基序富集结果的功能意义。

（5）IBD风险的细胞类型特异性富集：研究人员应用sLDSC分析IBD及其亚型（CD和溃疡性结肠炎）遗传力的细胞类型分布。29个细胞类型中有10个显示显著IBD风险富集（FDR<10%），全部为免疫细胞。T细胞（CD4⁺、CD8⁺、γδ T）和NK细胞在IBD、CD、溃疡性结肠炎、乳糜泻、类风湿关节炎和1型糖尿病中均有富集；固有免疫细胞（巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞）特异富集CD风险，而非溃疡性结肠炎风险，与两者的遗传结构差异一致。未发现上皮或间质细胞显著富集IBD风险，但肠内分泌细胞特异峰区显著富集体重指数（body mass index，BMI）遗传力。炎症特异主题（topic 7和9）不富集IBD风险，提示炎症相关染色质变化可能是疾病继发效应而非遗传易感性的直接来源。

（6）黏膜细胞类型中调控性CD变异的优先级排序：为将风险位点解析至具体变异和细胞类型，研究人员对CD GWAS信号进行SuSiE精细映射，获得87个位点的PIP。高PIP变异在cCREs中显著富集（3.5倍，P=0.011）。共34个变异满足PIP≥0.2且位于cCREs内，其中30个具有高整体主题可及性水平。通过主题负荷注释，这些变异主要落在先天免疫细胞和T细胞相关的cCREs中。以NOD2位点为例，rs146528649（PIP=1）位于中性粒细胞特异cCRE；两个位于CIITA附近的变异分别落在巨噬细胞/树突状细胞/T细胞/B细胞可及的cCRE与炎症特异上皮cCRE（topic 7），提示不同细胞类型中的多个非编码变异可能共同影响疾病风险。

讨论部分总结了该研究的意义：图谱扩展了此前scRNA-seq研究对CD黏膜炎症的认识，将炎症相关基因表达与上游调控元件和候选转录因子联系起来；结合遗传力富集分析与变异精细映射，研究明确CD遗传风险主要集中于免疫细胞，而上皮和间质细胞虽表现出强烈的炎症反应，但其对整体遗传风险的贡献较小，提示遗传风险与继发表型变化可被分离。研究同时承认队列规模限制了疾病亚组分析、caQTL检测效能及低丰度细胞类型的统计效力。未来更大样本队列将有助于实现疾病分层并提高跨细胞类型的调控变异检测能力。研究还发现多个位点存在同一可信集内两个变异定位至相邻但细胞类型特异性不同的cCREs，如CIITA位点，提示单一风险位点可能存在跨细胞类型的复合调控机制。该研究结论为：细胞类型分辨的染色质可及性图谱为理解CD和健康状态下的基因调控提供了全面资源，证明了将单细胞表观基因组与遗传精细映射相结合能够有效阐明复杂疾病的细胞类型特异性遗传机制，并为CD风险变异的机制性研究提供了候选靶点。