《Materials Today Communications》：Double-layer dehydrated amniotic membrane for ocular surface reconstruction: biological and biomechanical effects of processing and storage methods
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双层脱水人羊膜（human amniotic membrane, hAM）的厚度约为单层hAM的2.4倍。双层脱水法保留了最高水平的关键生长因子。冷冻保存降低生长因子含量的程度大于脱水法。低剂量次氯酸盐虽增强了膜的强度，但损伤了上皮细胞。双层脱水移植物可能更有
双层脱水人羊膜（human amniotic membrane, hAM）的厚度约为单层hAM的2.4倍。双层脱水法保留了最高水平的关键生长因子。冷冻保存降低生长因子含量的程度大于脱水法。低剂量次氯酸盐虽增强了膜的强度，但损伤了上皮细胞。双层脱水移植物可能更有利于支持眼表愈合。
论文解读文章
研究背景与目的
人羊膜（human amniotic membrane, hAM）因其抗炎、抗瘢痕、抗菌及促进上皮化的特性，被广泛应用于眼科眼表重建手术。其基底膜与基质层富含透明质酸、胶原蛋白以及多种生长因子，如表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等，这些生物活性分子可加速角膜上皮细胞的迁移、增殖与分化。尽管冷冻保存是长期以来保存hAM的标准方法，但其面临储存与处理的诸多挑战。近年来的研究表明，脱水后室温储存的hAM在简化物流与便利性方面具有优势。然而，加工方法的优化对于进一步提升hAM疗效仍至关重要，尤其是在保护其核心治疗成分——细胞因子与生长因子方面。此外，临床上有时会移植多层hAM以增强物理效应，但多层应用中的生长因子含量尚未得到充分研究。基于此，研究人员开发了一种双层脱水hAM，旨在评估不同加工技术（包括次氯酸钠处理、冷冻保存及双层脱水）对hAM生长因子保存与结构完整性的影响。
研究方法概述
本研究从一名健康足月剖宫产产妇处获取hAM（经CHA盆唐医疗中心伦理委员会批准并获知情同意），严格选取羊膜中区组织以减少区域异质性。研究分为四个实验：实验一采用不同浓度次氯酸钠（sodium hypochlorite, SH）处理hAM并进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色组织学评估及单轴拉伸力学测试；实验二通过将两片单层羊膜的基质面相对贴合制备双层脱水hAM，并于45°C烘干16小时至残余水分低于10%，行H&E染色测厚；实验三利用多重微珠免疫分析法（Luminex平台）定量检测四种加工条件（单层脱水、双层脱水、单层冷冻保存、0.025% SH处理后单层冷冻保存）下11种细胞因子与生长因子的释放浓度；实验四采用双光子显微镜比较双层脱水与单层冷冻保存hAM的微观结构，并再次进行力学测试。
研究结果
3.1 次氯酸钠对羊膜组织学与生物力学特性的影响
H&E染色显示，生理盐水处理的对照组羊膜上皮、基底膜及基质层完整。0.025% SH处理导致轻度上皮变薄及总膜厚度适度增加（122.8 μm vs. 111.1 μm）。而0.25% SH处理则引起显著的基质水肿及完全上皮脱落，总厚度增至192.7 μm，表明SH以浓度依赖性方式诱导基质水肿与结构改变。力学测试中，两种SH处理标本的最大点应力均高于对照组（0.025% SH为0.17 MPa，0.25% SH为0.15 MPa，对照组为0.03 MPa），其中0.025% SH还表现出最高的最大点应变（103.69%）。
3.2 双层脱水羊膜的结构完整性与厚度
双层配置中，两层羊膜的基质面在脱水过程中相互粘附，每层的结构完整性得以保持。脱水状态下，双层hAM厚度（67.5 μm）约为单层hAM（27.7 μm）的2.4倍，表明成功实现了层压而未损害结构完整性。
3.3 细胞因子与生长因子谱
定量分析显示，双层脱水组的总细胞因子/生长因子浓度及EGF水平均为最高（分别为41,553.2 ± 24,292.8 pg/mL和1,048.7 ± 427.6 pg/mL），显著高于单层脱水组（12,709.1 ± 9,554.2 pg/mL和548.5 ± 80.1 pg/mL）。单层冷冻保存组的相应水平显著低于双层脱水组。而经SH预处理后再冷冻保存的组别在所有组中水平最低。其余10种分析物的相对水平呈现相似趋势，唯胎盘生长因子（placental growth factor, PlGF）在双层脱水中相对较低。
3.4 储存方式相关的微观结构与力学性能比较
双光子显微镜显示，双层脱水膜的表面上皮致密均匀，基质胶原网络更为紧密；而冷冻保存膜的上皮结构异质性较高，可见细胞间隙。力学测试中，双层脱水膜的最大点应力高于冷冻保存膜（0.52 MPa vs. 0.26 MPa），但最大点应变较低（43.0% vs. 71.2%），表明脱水膜强度更高但延展性较差。
讨论与结论
讨论部分指出，SH处理虽然可能通过诱导胶原氧化交联增强hAM的机械强度，但同时造成上皮细胞损伤，导致生长因子含量大幅下降。冷冻保存在维持生长因子水平方面不如脱水有效，这可能与冰晶形成导致的细胞损伤有关。双层脱水hAM在提供更高膜厚度的同时，保留了最高的生长因子浓度，这对于需要高局部生长因子可用性的持续性角膜上皮缺损病例尤为有益。研究局限性包括体外设计、样本量较小、缺乏体内或临床验证，以及供体变异和羊膜区域异质性可能带来的影响。研究结论认为，尽管SH处理可增强hAM的机械鲁棒性，但也与生长因子水平降低相关；冷冻保存在维持生长因子水平方面效果逊于脱水；双层脱水hAM能比冷冻保存更有效地保留细胞因子与生长因子，同时允许室温储存与便捷操作，因此可能是眼表重建中一种兼具生物活性与后勤便利性的实用选择。
