《Nature Microbiology》：Systematic mapping of bacteriophage gene essentiality with HIDEN-SEQ
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噬菌体与其细菌宿主之间的军备竞赛推动了生物技术的重大突破，并将噬菌体塑造成具有巨大临床潜力的凶猛捕食者，用以对抗多重耐药细菌病原体。然而，噬菌体基因组中大量未知功能基因仍然是分子层面理解噬菌体-宿主相互作用的主要障碍。研究人员在此提出了HIDEN-SEQ（隐藏
噬菌体与其细菌宿主之间的军备竞赛推动了生物技术的重大突破，并将噬菌体塑造成具有巨大临床潜力的凶猛捕食者，用以对抗多重耐药细菌病原体。然而，噬菌体基因组中大量未知功能基因仍然是分子层面理解噬菌体-宿主相互作用的主要障碍。研究人员在此提出了HIDEN-SEQ（隐藏Acr使能转座子插入测序，hidden Acr-enabled transposon-insertion sequencing），一种适用于噬菌体的转座子插入测序方法，可系统地将病毒基因与可选择的表型联系起来。利用模型噬菌体T4，研究人员证明HIDEN-SEQ能够轻易重现数十年来建立的基因必需性图谱。该方法易于移植到多种非模式噬菌体，并能在多种细菌宿主和生长条件下揭示条件必需基因，包括研究人员将其匹配至特定抗病毒防御系统的先前未知抗防御因子。研究人员预计HIDEN-SEQ将被用于揭示与微生物生态学、生物技术和噬菌体疗法直接相关的病毒基因功能。
噬菌体是感染细菌的病毒，也是地球上最丰富、遗传多样性最高的生物实体。噬菌体与细菌宿主在数十亿年的共进化中形成了动态军备竞赛，不断塑造微生物群落、维持生态平衡并驱动全球生物地球化学循环。对少数模式噬菌体的研究曾揭示遗传密码的本质，并催生了分子克隆等关键技术突破；而在当前多重耐药菌感染日益严峻的背景下，噬菌体疗法也重新受到重视。然而，噬菌体基因组中大量功能未知的“暗物质”基因，严重阻碍了人们对噬菌体-宿主相互作用分子机制的理解，也限制了相关生物技术和临床应用的理性开发。因此，亟需一种可扩展的全基因组方法，将病毒基因与特定表型系统性地关联起来。研究人员开发了HIDEN-SEQ（隐藏Acr使能转座子插入测序），这是一种适用于噬菌体的转座子插入测序（TnSeq）方法，通过将高效转座插入与CRISPR-Cas13a选择相结合，实现了对噬菌体基因必需性的高分辨率解析。利用模型噬菌体T4，研究人员验证了该方法能够重现数十年来建立的基因必需性图谱；随后将其推广至不同非模式噬菌体，并成功鉴定出多种条件必需基因，包括多个先前未知的细菌抗防御系统抑制因子。该研究发表于《Nature Microbiology》。
在技术方法上，研究人员基于Himar1转座子构建了携带抗CRISPR基因（acrVIA1或AIcrVIA3）的选择标记，利用宿主中表达的LseCas13a或LbuCas13a核酸酶与靶向必需噬菌体基因转录本的CRISPR RNA（crRNA）进行筛选，使仅获得转座子的噬菌体突变体能逃逸Cas13a免疫并复制。通过深度测序定量比较不同条件下转座子插入位点的丰度，研究人员可评估各基因的突变适应度。研究中所用的临床样本来源为瑞士巴塞尔大学医院分离的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株，所有菌株经基因组测序和组装，并利用DefenseFinder预测其防御基因。
**HIDEN-SEQ enables TnSeq in phages**：研究人员以大肠杆菌K-12和噬菌体T4验证了HIDEN-SEQ的基本流程。输入文库的转座插入覆盖了97.2%的TA位点；经过生长选择后，190个基因被判定为在标准实验室条件下感染大肠杆菌K-12的非必需基因，与文献报道高度一致。少数基因（inh、hoc、segE、uvsW、segC和wac）在筛选中显示必需性而以往研究曾认为其非必需，可能源于转座极性效应；研究人员采用无转录终止子的转座子以减弱这种效应。此外，HIDEN-SEQ还能对基因破坏的适应度后果进行弱、中、强分级，并在亚基因分辨率上揭示功能结构域，例如T4 RNA连接酶A（rnlA）仅C端结构域耐受插入。
**HIDEN-SEQ identifies known and previously undescribed conditionally essential genes in phage T4**：研究人员用T4 HIDEN-SEQ文库感染表达不同防御系统的大肠杆菌宿主，特异性验证了已知抗防御基因rIIA/rIIB（抗RexAB）、dmd（抗RnlAB）、57B/acb1（抗CBASS）和30.3/adfN（抗DarTG1）的条件必需性。同时鉴定出一个先前未知的tk.4基因，仅在宿主表达DarTG2防御系统时表现必需；该基因编码的蛋白含有与结核分枝杆菌DarG抗毒素同源的宏结构域，被命名为抗DarT因子宏结构域（adfM）。此外，在M9最小培养基中，T4的vs基因（编码缬氨酰-tRNA合成酶修饰因子）出现显著消耗，证实其依赖营养条件的适应度效应。
**HIDEN-SEQ is applicable across different E. coli phages**：研究人员将方法扩展至T4近缘噬菌体Bas37和远缘的Vequintavirinae亚科噬菌体Bas54。Bas37与T4的整体必需性图谱高度相似，但存在个别基因差异，如Bas37的bas37_0061和bas37_0161表现出不同于T4的必需性，并通过靶向敲除验证。Bas54文库的TA位点饱和度达91.6%，鉴定出145个非必需基因；其44个必需基因中有15个缺乏功能注释，这些未知必需基因的敲除突变体出现严重生长缺陷，证实了注释结果。
**HIDEN-SEQ reveals new antidefence genes in different phages**：研究人员将三个噬菌体的转座子文库分别感染一组尿路致病性大肠杆菌临床分离株，在每个噬菌体-宿主组合中均鉴定出多个插入量显著减少的基因，提示其条件必需作用。通过克隆临床菌株中的防御系统并异源表达，研究人员确认了多个新的抗防御因子：T4的Alt和Bas37的βα-葡萄糖基转移酶（βα-gt）参与逃避Mokosh I型防御系统；T4的nrdC.1和Bas37的bas37_0203分别针对Septu和Druantia III型防御系统；Bas37的bas37_0260被证实为先前未知的IV型限制系统McrBC抑制剂；Bas54的bas54_0063和bas54_0140则对抗DS-28预测防御系统。这些因子大多无已知功能注释，凸显了HIDEN-SEQ在揭示噬菌体“暗物质”功能方面的价值。
在讨论部分，研究人员将HIDEN-SEQ与CRISPRi-ART、PhageMaP等近期方法进行了比较，指出HIDEN-SEQ无需预先知道基因位置或准确的起始密码子，仅需单个crRNA即可完成选择，并且产生的高密度插入文库可重复用于不同宿主和条件，尤其适合发现条件必需基因和未知功能基因。同时，该方法还能定位非必需基因组区域，为噬菌体工程改造提供直接指导。研究结论部分翻译如下：总而言之，HIDEN-SEQ提供了一个多用途平台，将噬菌体表型与其潜在基因及分子机制联系起来。它能够在标准实验室条件之外（包括感染临床分离株和不同生长环境）进行高通量噬菌体-宿主互作图谱构建，还能揭示可缺失的基因组区域，直接服务于临床和生物技术应用的噬菌体工程。展望未来，HIDEN-SEQ的巨大效用和效能，使其成为解决噬菌体生物学复杂问题的有力工具，对噬菌体疗法、微生物生态学和生物技术创新具有深远意义。
