《Journal of Phycology》：Lithochloron, a new genus of green algae residing in coral skeleton (Cladophorales, Chlorophyta)
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珊瑚骨骼栖息着多样的微生物群落，包括对宿主全生物功能有贡献的内生绿藻。管状绿藻Ostreobium（羽藻目）可以说是最著名的珊瑚内生藻，但最近的环境测序表明，其他绿藻谱系也可能栖息于珊瑚骨骼中，包括刚毛藻目（Cladophorales）的成员。本研究描述了一种
珊瑚骨骼栖息着多样的微生物群落，包括对宿主全生物功能有贡献的内生绿藻。管状绿藻Ostreobium（羽藻目）可以说是最著名的珊瑚内生藻，但最近的环境测序表明，其他绿藻谱系也可能栖息于珊瑚骨骼中，包括刚毛藻目（Cladophorales）的成员。本研究描述了一种从澳大利亚大堡礁南部苍鹭岛采集的Porites珊瑚骨骼中分离出的新型内生绿藻。该藻形成由细长营养细胞组成的单列、稀疏分枝的草绿色丝状体，横壁稀少。基于18S和28S nrDNA基因序列的系统发育分析将该菌株置于羽藻纲（Ulvophyceae）刚毛藻目（Cladophorales）Siphonocladus支系内的一个早期分化谱系。基于形态学和分子学证据，研究人员将该藻描述为新属新种Lithochloron capricornicum。对大堡礁珊瑚环境18S nrDNA基因扩增子数据的分析揭示了广泛的序列多样性，表明该属还存在其他未描述的物种。环境测序进一步表明，该属在珊瑚骨骼中等深度处最为丰富，并提示其与Ostreobium沿骨骼垂直光梯度存在生态位分化，Lithochloron的丰度峰值趋于比Ostreobium更浅的深度。Lithochloron的发现挑战了长期以来认为Ostreobium是珊瑚骨骼中唯一优势内生绿藻的假设，并突显了内生藻类多样性被广泛低估的事实。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
造礁珊瑚（石珊瑚目）通过沉积文石质碳酸钙骨骼，支撑着热带珊瑚礁生态系统的结构复杂性和生物生产力。珊瑚并非作为单一生物体运作，而是以全生物（holobiont）的形式存在，其动物宿主与细菌、古菌、真菌、病毒和藻类等多种微生物紧密关联。其中研究最为深入的是共生甲藻（Symbiodiniaceae科），它们通过光合作用固定碳的转运为珊瑚宿主提供大部分能量需求。
珊瑚骨骼的多孔结构形成了光、氧和pH的物理化学梯度，驱动着骨骼微生物组的显著垂直分层。尽管骨骼环境对光合生物而言看似恶劣——光照极低且氧和pH波动剧烈——骨骼中仍栖息着光合自养生物。其中最为著名的是羽藻目（Bryopsidales）的管状绿藻Ostreobium属，它们在全球活体和死亡石珊瑚骨骼中普遍存在，在珊瑚组织下方形成显著的绿色条带，仅能接收到水面光合有效辐射（PAR）的0.01%–2%。Ostreobium已演化出显著的环境适应策略，包括富集特殊色素（如siphonein）以及基因组编码扩展的光捕获复合体（LHC）蛋白和大量氧化应激响应基因。
然而，除Ostreobium外，仅有少数绿藻谱系被报道存在于珊瑚骨骼中。此前研究在Ulvophyceae中发现了内生生活方式的多次独立起源，其中五个18S rRNA基因操作分类单元（OTU）被归入刚毛藻目（Cladophorales），这是该目作为内生藻的首次记录。尽管环境测序不断提供新证据，珊瑚相关Cladophorales在形态学、分类学和生态学层面仍未得到充分表征。本研究旨在从形态学上表征一种从珊瑚骨骼中分离的新型内生绿藻，确定其系统发育位置，并通过分析环境测序数据集评估该谱系在珊瑚骨骼中的更广泛多样性和微生境关联。
二、研究内容与主要结论
研究人员从澳大利亚大堡礁南部苍鹭岛采集的浅水块状Porites珊瑚骨骼中分离出新型绿藻菌株UM1。通过形态学观察、分子系统发育分析和环境测序数据分析，得出以下主要结论：
该藻在培养中形成由交织的草绿色丝状体组成的簇状叶状体，呈简单的单列结构，由长的营养细胞系列组成。细胞极为细长，横壁形成极为稀少且无规律可循，未观察到细胞质流动。分枝非常稀疏，横壁常（但非 exclusively）出现在分枝附近。细胞直径范围为（5-）7-9 μm。幼嫩生长丝状体具有细长叶绿体，而较老细胞倾向于具有更圆的原体（plastid）和更厚的细胞壁。每个叶绿体似乎含有一个蛋白核（pyrenoid），经Lugol染色证实含有淀粉。
基于18S和28S nrDNA基因序列的串联系统发育分析表明，菌株UM1明确嵌套在Siphonocladus支系内，形成一个非常独特且早期分化的谱系。该支系包含Anadyomenaceae、Boodleaceae、Siphonocladaceae和Valoniaceae科的成员。虽然Siphonocladus支系主干上的统计支持度较差，无法确定UM1在该支系内的确切位置，但其与其他属的清晰分离支持将其描述为新属新种。
环境测序分析显示，UM1菌株与大堡礁珊瑚的多个扩增子序列变体（ASV）密切相关，其中一个ASV（代码aaf58）与UM1菌株完全匹配。各ASV之间在18S nrDNA基因V9区的序列分歧度（未校正p距离）介于0.31%至1.58%之间。多个ASV在Porites珊瑚骨骼中间深度处丰度最高，且这些ASV均未在周围海水或礁沙中检测到。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：珊瑚骨骼碎片在低光照条件下培养以分离内生藻菌株；光学显微镜观察活体丝状体形态；高通量DNA提取结合PacBio HiFi测序技术获取全核糖体DNA（nrDNA）序列；hifiasm组装和Barrnap自动注释核糖体RNA基因；MAFFT进行18S和28S nrDNA基因序列比对，PhyKIT串联比对，IQ-TREE构建最大似然（ML）系统发育树，MrBayes进行贝叶斯推断（BI）；以及基于大堡礁珊瑚环境18S nrDNA基因V9区扩增子测序数据（来源于Heron Island珊瑚样本）的UPGMA距离树分析和骨骼内深度分布分析。
四、研究结果
形态学观察： 培养的菌株UM1形成由交织草绿色丝状体组成的簇状叶状体，呈简单单列结构，由长营养细胞系列组成。细胞极为细长，横壁形成极为稀少且无规律，分枝非常稀疏。细胞直径范围为（5-）7-9 μm，幼嫩丝状体具有细长叶绿体，较老细胞倾向于具有更圆的原体和更厚的细胞壁，每个叶绿体含有一个蛋白核。
系统发育位置： 基于18S和28S nrDNA基因序列的ML系统发育树显示，菌株UM1明确嵌套在Siphonocladus支系内，形成一个非常独特且早期分化的谱系。Cladophoraceae与Siphonocladus支系互为姐妹群，两者共同与Pseudocladophoraceae + Pithophoraceae谱系形成姐妹关系。
环境序列分析： 环境测序分析显示UM1菌株与大堡礁珊瑚的多个ASV密切相关，其中一个ASV（aaf58）与UM1菌株完全匹配。ASV间序列分歧度为0.31%–1.58%。多个ASV在Porites珊瑚骨骼中间深度（约12–18 mm）处丰度最高，且未在周围海水或礁沙中检测到。
五、讨论与结论
基于形态学观察和系统发育分析的组合证据，研究人员将菌株UM1描述为新属新种Lithochloron capricornicum。该属名源自希腊语lithos（石头）和chloros（绿色）的中性形式，指代这种绿藻的内生习性；种加词指苍鹭岛所属的大堡礁南部Capricorn群岛。
与形态相似藻类的比较显示，Lithochloron与Ostreobium虽然共享内生栖息地、微小体型、简单结构和培养中不规则分枝模式，但两者在多方面明显不同。Lithochloron是多细胞生物，具有横壁（尽管间隔宽阔且不规则），而Ostreobium是管状的，完全缺乏营养隔膜。两者细胞直径相似，但Ostreobium的叶绿体通常小而椭球形且缺乏蛋白核。与Siphonocladus支系中更近缘的类群相比，Lithochloron在形态上明显不同——该支系成员通常具有大一到两个数量级的细胞，含有中央大液泡和周围 parietal 叶绿体网络。由于培养细胞周围厚厚的黏液层阻止核染色剂渗透，研究人员无法确认Lithochloron是否具有Siphonocladus谱系典型的多核性质和细胞质域。Lithochloron的分枝模式也不提示其具有分离性细胞分裂（segregative cell division）。与Chaetosiphon属的比较显示两者共享相对狭窄的分枝和相似形状与分布的叶绿体，但Lithochloron完全缺乏Chaetosiphon特有的无色螺旋状毛状结构。
环境测序显著增强了对该属生物多样性和生态学的认识。距离分析显示，除本文描述的物种外，Lithochloron属还包含额外的多样性，其18S nrDNA基因V9区的分歧水平与Boodlea复合群相当，强烈表明该属包含多个物种。环境序列还精确揭示了该属的生态位：Lithochloron是严格的内生物种，从不出现于珊瑚组织（深度0），而是在骨骼约12–18 mm深度处达到最大密度。不同珊瑚间的精确最适深度存在差异，这可能与不同群体骨骼中的光可利用性有关。
尤为重要的是，Lithochloron在某些样本中的丰度几乎与最丰富的Ostreobium ASV相当，在一个骨骼样本中甚至显著高于最丰富的Ostreobium ASV。这一发现对长期以来假设珊瑚骨骼中的绿色内生藻类属于研究较为充分的Ostreobium属的观点构成严峻挑战，表明实际往往是Lithochloron和Ostreobium的混合群落，在某些情况下前者占据优势。此外，在FRH48和FRH50骨骼中，Lithochloron aaf58的丰度峰值出现在比Ostreobium d48e8更浅的深度，提示两者之间存在生态位分化，Lithochloron可能受益于靠近珊瑚表面稍强（但仍然很暗）的光照。
研究结论指出，Lithochloron的发现挑战了Ostreobium是珊瑚骨骼中唯一优势内生绿藻的长期假设，突显了内生藻类多样性被广泛低估的事实。该属可能像Ostreobium一样物种丰富且生理多样，未来需要更多研究来全面理解其形态学、多样性和生态功能。
