MERTK依赖性胞葬作用通过Cx3cr1表达髓系细胞支持雄性小鼠创伤性脑损伤后恢复

《Neurobiology of Disease》：MERTK-dependent efferocytosis in Cx3cr1-expressing myeloid cells supports recovery after traumatic brain injury in male mice

　　

创伤性脑损伤后，损伤皮层中MERTK和GAS6表达上调。内皮细胞特异性MERTK缺失对急性损伤结局无可检测影响。Cx₃cr1表达细胞中MERTK缺失损害凋亡细胞清除。Cx₃cr1特异性MERTK缺失与更严重的组织和血管损伤相关。Cx₃cr1表达细胞中MERTK缺失损害功能恢复。

创伤性脑损伤（TBI）是导致全球发病率和死亡率的主要原因，其病理不仅包括原发性机械损伤，还包括以神经元凋亡和神经炎症为特征的继发性损伤。凋亡细胞在损伤部位的积累会加剧炎症并扩大组织损害，因此高效清除凋亡细胞是限制继发性损伤、促进恢复的关键。胞葬作用（efferocytosis）即吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬清除，在维持组织稳态、消退炎症和组织修复中发挥核心作用。在中枢神经系统（CNS）中，胞葬作用失调与多种神经疾病有关，并可能影响TBI结局。小胶质细胞和外周来源巨噬细胞是脑损伤后清除凋亡细胞的主要吞噬细胞，但调控其促消退性胞葬活性的机制尚不清楚。Cx₃cr1表达髓系细胞，包括常驻小胶质细胞和浸润性单核细胞来源巨噬细胞，构成了损伤脑内主要的吞噬细胞群体。MERTK是TAM家族受体酪氨酸激酶，通过桥接配体GAS6识别凋亡细胞膜上暴露的磷脂酰丝氨酸，启动吞噬并抑制炎症信号。在CNS中，MERTK表达于小胶质细胞和浸润巨噬细胞，也存在于内皮细胞，参与血管稳态调控。尽管单细胞转录组分析提示MERTK与GAS6参与TBI后的神经血管过程，但MERTK在TBI后的细胞特异性功能贡献仍未明确。为此，研究人员采用细胞类型特异性遗传学方法，探究MERTK是否分别通过内皮细胞或Cx₃cr1表达髓系细胞介导 TBI后的保护作用。

研究人员利用条件性基因敲除小鼠，在成年雄性小鼠中建立控制性皮质冲击（CCI）损伤模型。结果显示，损伤皮层中MERTK及其配体GAS6在伤后1至7天表达上调。内皮特异性Mertk敲除小鼠在病变体积、血脑屏障（BBB）通透性和凋亡细胞积累方面与对照组无显著差异。而在Cx₃cr1表达细胞中敲除Mertk则显著加剧组织损伤和血管功能障碍，损害胞葬作用，导致凋亡细胞积累增加，并损害脑血流恢复和运动/认知功能。该研究首次明确了Cx₃cr1表达髓系细胞中的MERTK是TBI后凋亡细胞清除和神经功能恢复的关键调节因子，为靶向MERTK信号促进脑外伤修复提供了理论依据。

关键技术方法：研究使用Cx₃cr1^creERT-EYFP、Mertk^f/f和VE-Cadherin^CreERT小鼠，均回交至CD1背景10代，生成Mertk^f/fVE-Cadherin^CreERT内皮特异敲除和Mertk^f/fCx₃cr1^creERT-EYFP髓系特异敲除成年雄性小鼠，以Mertk^f/f和Cx₃cr1^creERT-EYFP同窝为对照。CCI损伤采用3 mm圆头冲击器（速度5.0 m/s，深度2 mm，停留150 ms）。主要技术包括Western blot、免疫组化/免疫荧光共聚焦、TUNEL染色、IMARIS三维重建与距离分析、体视学计数、NISSL染色病变体积测量、IgG沉积评估BBB通透性、激光散斑成像检测脑血流、转棒和T迷宫行为测试，以及GFP骨髓嵌合体结合流式细胞术（CD11b、CCR2、Ly6G等）鉴定浸润细胞。共使用150只小鼠，包括68只Mertk^+/+Cx₃cr1^creERT-EYFP、68只Mertk^f/fCx₃cr1^creERT-EYFP等。

研究结果：

3.1 CCI损伤后损伤皮层中MERTK和GAS6上调
通过Western blot检测伤后1、4、7天皮层蛋白，发现MERTK在伤后1天轻度升高，4天和7天进一步上调；GAS6在1天即升高并持续维持。免疫组化显示，伤后1天MERTK和GAS6与CD31阳性内皮细胞相关；伤后3天，Cx₃cr1阳性细胞表达MERTK和GAS6，三维重建显示MERTK阳性Cx₃cr1细胞与GAS6阳性细胞紧密接触，提示正在进行的吞噬活动。

3.2 内皮特异性Mertk缺失不显著改变CCI损伤后的病变体积或凋亡细胞积累
使用VE-Cadherin^CreERT驱动内皮Mertk敲除，与Mertk^f/f对照相比，伤后3天NISSL染色测定的病变体积、IgG沉积评估的BBB通透性、活化caspase-3阳性凋亡细胞数量均无显著差异。免疫组化确认内皮MERTK缺失，但IBA1阳性小胶质细胞/巨噬细胞中MERTK表达未受影响。

3.3 Cx₃cr1表达细胞中Mertk缺失加剧CCI损伤后的组织损伤和血管功能障碍
在Mertk^f/fCx₃cr1^creERT/+小鼠中，伤后3天病变体积显著增大，IgG沉积总量及扣除病变体积后的沉积量均显著高于对照。免疫组化确认Cx₃cr1阳性细胞中MERTK缺失，且Cx₃cr1⁺CCR2⁺浸润单核细胞/巨噬细胞和Cx₃cr1⁺TMEM119⁺常驻小胶质细胞均缺失MERTK，证明两种髓系亚群均被有效靶向。

3.4 Cx₃cr1表达细胞中Mertk缺失损害胞葬作用并增加凋亡细胞积累
活化caspase-3阳性细胞数在Mertk缺陷小鼠中显著增加。TUNEL染色与IMARIS分析显示，Mertk缺陷小鼠的TUNEL阳性细胞核与Cx₃cr1阳性细胞的距离增加、包裹减少，且TUNEL阳性核积累增多。此外，Mertk缺陷小鼠的Cx₃cr1阳性细胞中DNAse2和LAMP1定位减少，IBA1⁺LAMP1⁺细胞含溶酶体DAPI puncta的数量显著降低，表明吞噬后溶酶体降解受损。直接定量显示，Mertk缺陷小鼠中Cx₃cr1⁺/IBA1⁺吞噬细胞吞噬TUNEL阳性核的数量和百分比显著降低，而非吞噬性Cx₃cr1⁺/IBA1^?细胞无变化，证明MERTK是Cx₃cr1表达吞噬细胞高效胞葬作用所必需。

3.5 Cx₃cr1表达细胞中Mertk缺失损害脑血流和功能恢复
激光散斑成像显示，Mertk缺陷小鼠在伤后3天和7天时皮层灌注显著低于对照，提示脑血流恢复受损。转棒测试显示，Mertk缺陷小鼠在伤后3天和7天时运动协调性显著下降；T迷宫自发交替测试显示，在伤后3、7、14天时空间工作记忆均显著受损。假手术组未见基因型差异，说明Mertk缺失本身不改变基线行为。

讨论与结论：
讨论部分指出，尽管既往研究显示内皮MERTK参与血管屏障调节，但在本研究CCI模型中，内皮特异性Mertk缺失未显著影响急性损伤结局，提示其作用具有组织或损伤模型依赖性。相比之下，Cx₃cr1表达细胞中的MERTK通过介导凋亡细胞吞噬和溶酶体加工发挥组织保护作用。MERTK在CNS损伤中的作用具有情境依赖性：在缺血或缺氧模型中可能参与清除应激但可存活的神经元（吞噬现象），而在TBI模型中表现为保护性。研究局限性包括：仅使用雄性小鼠；Cx₃cr1^CreER不能区分小胶质细胞与浸润巨噬细胞的相对贡献；样本量（尤其内皮队列）有限，可能无法检测微小效应；组织学分析主要集中于急性期，长期重塑需进一步研究。结论翻译：总之，本研究发现Cx₃cr1表达细胞中的MERTK是雄性小鼠TBI后凋亡细胞清除的重要调节因子。虽然内皮特异性Mertk缺失在所检查条件下未产生可检测的急性损伤结局变化，但Cx₃cr1表达细胞中MERTK缺失损害了胞葬作用、增加了组织损伤和血管功能障碍，并恶化了神经功能恢复。这些发现支持进一步研究MERTK依赖性胞葬作用作为脑外伤后组织修复和功能恢复的潜在贡献机制。