基于纳米孔自适应采样的帕金森病与重复扩增障碍统一长读长基因面板研究

《npj Parkinson's Disease》：Unified long-read panel for Parkinson’s and repeat expansion disorders

　　

本研究设计了一个基于纳米孔（Nanopore）长读长测序（long-read sequencing, LRS）并使用自适应采样（adaptive sampling）技术的基因面板，靶向与帕金森病（Parkinson's disease, PD）及重复扩增障碍（repeat expansion disorders）相关的n=564个基因。研究人员在n=18例患者中评估了其诊断效用，这些患者包括：（1）携带LRRK2、PRKN、SNCA和RAB32致病性变异者（n=7）；（2）特发性PD或额颞叶痴呆（FTD）且已知遗传病因检测阴性者（n=3）；（3）携带ATXN1、ATXN2、ATXN3、C9orf72、DAB1、FGF14、HTT和TAF1-SVA重复扩增者（n=8）。每张流动槽（flow cell）复用三个样本，实现了每个样本平均24X（标准差SD=±9X）的覆盖深度。最终，20个预期致病性变异中的17个被成功鉴定（85%；Clopper-Pearson 95%置信区间CI: 62–97%）；即一个SNCA三倍化以及两个分别位于C9orf72和TAF1-SVA的重复扩增未被检出。此外，在五例患者中还发现了STXBP2、AP4S1、RARS2、ALS2和CNBP的额外变异。自适应采样是一种适用于神经退行性疾病的多功能遗传诊断工具，同时可实现经济高效的样本复用。仍需进一步的验证以及生物信息学分析的改进。

研究背景与研究目的

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是全球第二大且增长最快的神经退行性疾病，预计2021年至2050年间全球患者数量将增加112%，主要源于人口老龄化。目前PD的诊断仍依赖于神经退行性变导致的运动特征，但由于症状和体征的异质性，诊断过程颇具挑战。遗传学检测正越来越多地用于辅助诊断，并为治疗反应和家族风险评估提供依据。然而，高达15%的PD患者可检出遗传变异，但可变外显率和意义未明变异（variants of unknown significance, VUS）使检测复杂化。临床特征和家族史常指导遗传检测的选择，若无法确定遗传病因，则需进行序贯检测，例如外显子组测序后接多重连接依赖性探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）以检测结构变异（structural variants, SVs），这一过程成本高昂且耗时费力。新型测序技术，特别是长读长测序（long-read sequencing, LRS），已能发现多个重复扩增障碍位点，并可测序包括大型SVs和短串联重复序列（short tandem repeats, STRs）在内的困难区域。牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies, ONT）提供的靶向LRS方法称为自适应采样（adaptive sampling），其原理是将正在测序的读段实时比对至预定义的目标区域，仅完全测序匹配区域的读段，而脱靶读段则被排出纳米孔，从而实现目标富集和更深覆盖度。尽管自适应采样在检测单核苷酸变异（single-nucleotide variants, SNVs）、插入缺失（indels）和重复扩增方面已有研究，尤其在共济失调领域，但在其他运动障碍疾病中，尤其是涉及大型结构变异的致病性变异，仍缺乏充分探索。为此，研究人员设计了一个包含564个与PD、重复扩增障碍及其他神经退行性和运动障碍相关位点的新型基因面板，采用自适应采样技术联合检测分相SNVs、indels、大型SVs和重复扩增，旨在评估该技术路径的可行性及其潜在的诊断效用。

主要关键技术方法

研究人员从18例已知遗传变异的个体（15例阳性对照和3例阴性对照）中提取基因组DNA，其中4例来自诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）系，其余来自全血。使用Megaruptor 3对DNA进行受控剪切，并通过BluePippin进行片段筛选，目标片段≥30 kb。文库制备采用Native 96 Barcoding Kit，每张R10.4.1流动槽复用三个样本，在PromethION平台上运行72小时。在MinKNOW软件中激活自适应采样功能，基于BED文件（含GRCh38坐标及±50 kb侧翼序列）富集所有基因位点，目标区域总长度占参考基因组的3.44%。生物信息学分析使用ONT的EPI2ME人类变异分析流程（包含Clair3用于小变异检测、Sniffles2用于SV检测、Straglr用于串联重复变异检测），并结合Noise Cancelling Repeat Finder（NCRF）分析重复扩增位点，以及使用Integrative Genomics Viewer（IGV）进行可视化验证。

研究结果

读段质量与基因面板覆盖度

每个样本的平均比对靶向读段数为420,408（SD=±244,251），平均Phred质量得分为19.7（SD=±2.2），平均靶向读段N50为21.5 kb（SD=±11 kb）。所有样本的平均靶向覆盖度为24X（SD=±9X）。不同基因位点的覆盖度差异显著：SNCA和LRRK2的平均覆盖度≥25X，而GBA1和TAF1的平均覆盖度约为15X，线粒体DNA（mtDNA）的平均覆盖度达1256X。

利用EPI2ME检测已知致病性变异

EPI2ME流程中的Clair3正确检出了全部6个已知致病性小变异，包括GBA1 c.1223C>T（p.T408M）、LRRK2 c.6055G>A（p.G2019S）、三个PRKN变异（c.823C>T、c.971del、c.101_102del）以及RAB32 c.213C>G（p.S71R）。Sniffles2正确检出了两个大型PRKN缺失（≥200 kb），但未能识别另外三个PRKN缺失以及一个1.7 Mb的SNCA三倍化。Whatshap确认了SFC817中两个PRKN变异的复合杂合性。CuteSV在调整参数后额外检出了两个先前漏检的PRKN缺失。Straglr正确鉴定了四个致病性重复扩增：ATXN1（CAG）₄₅、ATXN2（CAG）₃₄、ATXN3（CAG）₇₀和HTT（CAG）₄₅。由于EPI2ME内置的重复位点列表尚未包含FGF14、DAB1和TAF1，Straglr未能直接检出这些位点的致病性重复扩增。独立版Straglr使用自定义输入BED文件后检出了DAB1（ATTTC）₁₂₃和FGF14（GAA）₃₅₀的重复扩增，但TAF1-SVA重复扩增仍未检出。C9orf72重复扩增因读段数不足而被判定为良性。

利用Noise Cancelling Repeat Finder检测已知致病性变异

NCRF确认了Straglr检出的ATXN1（重复数RN=42）、ATXN2（RN=34）、ATXN3（RN=70）和HTT（RN=41）重复扩增，偏差为3-4个重复单元。NCRF还检出了DAB1（ATTTC）₁₀₅和FGF14（GAA）₃₄₉的重复扩增，其中DAB1的重复单元数偏差较大（18个单元）。对于C9orf72，NCRF虽检测到13个高重复长度读段（2000-10000 bp），但因高度变异无法确定精确重复数。TAF1-SVA重复扩增仍未被检出。

在Integrative Genomics Viewer中评估变异

通过IGV可视化，研究人员确认了EPI2ME和NCRF未检出的六个已知致病性变异的存在。在iPS-L-3244中观察到跨越PRKN外显子1的20 kb缺失；在L-13754中确认了跨越PRKN外显子2-3的320 kb缺失；在iPS-L-3034中确认了分别跨越外显子3-5和外显子2的两个PRKN缺失（250 kb和112 kb），且均为复合杂合状态。对于SFC831中的SNCA三倍化，虽未在IGV读段中直观识别，但SNCA的覆盖度较所有其他基因位点的平均覆盖度增加了2.5倍。对于L-20799中的C9orf72重复扩增，41个覆盖读段中有6个显示扩张范围在2877至9944 bp之间。对于L-14372中的TAF1插入，7个靶向读段中有3个携带约2.7 kb的插入。由于携带重复扩增的读段数量少且重复长度差异大，这两个位点的检测被归类为不确定。总体而言，20个已知致病性变异中有17个被明确鉴定（85%），三个未准确检出的变异包括一个SNCA三倍化和两个大型重复扩增（C9orf72和TAF1-SVA）。

检测额外致病性变异

通过对EPI2ME输出进行过滤，研究人员发现了14个此前未报告的候选变异，其中4个潜在致病性SNVs/SVs和1个意义未明的重复扩增经Sanger测序或PCR及琼脂糖凝胶电泳验证。具体包括：L-13754中STXBP2的剪接位点SNV（c.1247-1G>C），预测导致剪接受体丢失，ACMG评分为致病性；L-1689中AP4S1的错义SNV（c.43C>T），与痉挛性截瘫52型（SPG52）相关；SFC817中RARS2的移码缺失（c.160_161delAA），与桥脑小脑发育不全6型（PCH6）相关；iPS-L-3034中ALS2的1.4 kb缺失，与青少年肌萎缩侧索硬化症2型相关；L-15764中CNBP的（CCTG）₁₃₇重复扩增，与强直性肌营养不良2型（DM2）相关。所有患者均无对应合并症的临床表现，提示这些为偶然发现。

讨论与结论

本研究中开发的基于ONT自适应采样的基因面板，通过聚焦于相关基因，在三样本复用条件下实现了>20X的平均覆盖度，足以稳健检测SNVs、小indels和SVs，且成本低于全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）。不同基因位点的覆盖度差异较大，部分归因于某些基因位于难以定位的区域（如MHC复合体、X连锁基因等）。研究建议针对易形成SVs的区域（如PRKN所在常见脆性位点）增加侧翼序列长度。当前SV检出工具（如Sniffles2、SVIM、CuteSV）尚无通用金标准，均需手动调整参数，阻碍自动化。对于SNCA三倍化这类大型拷贝数变异，现有SV检出器均无法识别，凸显开发专门针对靶向测序数据的拷贝数检测工具的必要性。对于重复扩增，C9orf72和TAF1-SVA的检测因读长限制、覆盖度不足及参考基因组缺失SVA插入序列而面临挑战。研究建议将复用样本数减至两例以提高覆盖度至>30X，从而优化重复扩增检测。

研究结论：该ONT自适应采样基因面板在所有测试的变异类型中展现出强大的检测能力，包括分相的大型SVs和长重复扩增，突显了其作为一种经济高效的方法在未来临床诊断中发挥长读长测序优势的潜力。该面板可通过修改BED文件灵活适应新发现的基因和重复基序，并能应对组合或不典型表型。作为一线方法（综合捕获分相SNVs、大型SVs和重复扩增）或二线方法（在NGS结果阴性或不明确后使用）均具应用前景。研究也指出了当前局限性，包括需更大规模队列验证、对大型重复扩增的深入表征仍待提升、多数长读长软件针对WGS数据优化而非靶向测序数据等。随着更多专用工具的出现，单一综合性检测的优势将日益凸显。