近期发表在《自然》（Nature）上的一项研究中，Taneja等1发现，复制应激会触发形成瞬时的、以CTCF为锚点的、被G9a/H3K9me3包被的染色质环，这些环将停滞的复制叉包裹在内，从而保护新生DNA免于核酸酶降解。这些发现定义了一个叉保护的结构层次，其功能独立于已知的BRCA2依赖的复制叉保护活性。

在应激条件下停滞的复制叉是脆弱的结构。如果没有足够的保护，MRE11和DNA2等核酸酶会降解暴露的新生DNA，导致突变和重排，而这些是癌症中基因组不稳定的基础。为了避免这种情况，细胞拥有一套处理停滞复制叉的机制，例如重新引发和跨损伤合成。另一个研究深入的、重要且关键机制是复制叉逆转2，即形成一种"鸡爪"结构（'chicken foot' structure），该结构可辅助DNA修复或模板转换。在此过程中，同源重组（HR）因子如RAD51、BRCA1和BRCA2对回缩臂（regressed arms）起到保护作用（图1a, b）。

图1
图 1
全尺寸图片

ATR协调应激复制叉的多层保护机制。a 复制叉重塑：RAD51和转位酶（如SMARCAL1）驱动复制叉回缩与逆转，随后由BRCA2和RAD51稳定以保护其免于核酸酶降解。与此同时，停滞复制叉处的H3K4me1作为FANCD2结合的底物，而FANCD2的组蛋白伴侣活性则限制了CHD4染色质重塑活性在叉位的作用，提供进一步保护。b 染色质重组：G9a启动H3K9me1的沉积，随后在Suv39h1的作用下依次延伸为H3K9me3，连同HDAC活性一起促进局部新异染色质形成，从而限制KDM3A去甲基化酶活性，以此调控复制叉重启。同时，RNF8/RNF168依赖的H2AK(13-15)ub，连同新生组蛋白标记H4K20me0和H4K16ac0，促进BRCA1-BARD1的募集和复制叉压缩，防止非计划性复制叉重启和核酸酶降解。c 环形成：G9a依赖的H3K9me3扩展，包被一个以CTCF为锚点的染色质环，从而包裹并保护停滞的复制叉。详见正文。

本研究的作者此前已证明，G9a（EHMT2）甲基转移酶在停滞复制叉处的局部募集可直接促进新的H3K9me1沉积，进而形成H3K9me3（图1b），且该信号在水杨脲（HU）处理后约一小时内逐步积累。3他们证明这一活性通过阻止PRIMPOL介导的不当复制叉重新引发（图1b），在逆转复制叉处提供了额外的保护层。当应激源被移除后，这种异染色质积累会随之解体，以允许复制叉重启。然而，高级染色质结构本身是否贡献了一个独立的保护层，一直是一个悬而未决的问题。

如今，作者利用两种新开发的测序方法——Rep-ChIC和Rep-Hi-C（两者均特异性地富集新合成的、经BrdU标记的DNA）——展示了这一标记只是更大事件的开端：一种可全局检测到的异染色质化波，它与包裹应激复制域的离散染色质环的稳定化相吻合（图1c）。这些环的边界形成于预先存在的拓扑关联结构域（TAD）边界之内，而非恰在边界之上，因此构成了一个瞬时的结构层次，在其中大规模的稳定组织基本保持不变。

这些保护性的、复制应激依赖的环的形成依赖于两个协作因子的作用。首先，在应激条件下，CTCF以ATR依赖的方式被募集至收敛型CTCF结合基序。一旦结合，CTCF便限制了凝缩蛋白（cohesin）介导的环挤出4，因此ATR依赖的CTCF结合将起到锚定新形成环的作用。

与此同时但彼此独立地，ATR还驱动G9a介导的H3K9me3沉积，该修饰扩散并包被整个环体。电子显微镜和Fork-deg-seq（一种可直观定位新生链降解位点的新测序方法）揭示了一种分工模式：CTCF主要在环锚点处保护逆转复制叉的游离DNA末端，而G9a和H3K9me3则为环体内复制叉后方的新合成DNA提供广泛保护，包括未逆转的复制叉。两种因子的联合缺失具有叠加效应，使复制叉结构暴露于广泛的核酸酶攻击，作者证明这一表型在很大程度上独立于复制叉逆转——后者无论环的完整性如何，均正常进行。CTCF在此还具有一种第二种类似绝缘子的功能，将H3K9me3限制在环体内，而不允许其扩散至侧翼染色质。作者发现环的形成并不均匀分布，环较多的基因组区域比环较少的区域更受应激诱导降解的保护，进一步凸显了环形成的保护作用。

或许最引人注目的功能结果是，即使BRCA2被耗竭，环包裹内的新生DNA仍然受到降解保护，而环较少的区域——特别是早复制脆弱位点——仍然本质上更为脆弱。这表明结构性复制叉保护在机制上与BRCA通路轴不同，而非处于该通路的下游（图1）。值得注意的是，它也不同于双链断裂（DSB）的染色质应答——后者中，ATM和凝缩蛋白依赖的环挤出促进DNA损伤信号传导并辅助同源序列搜索。5在此，复制应激反而利用挤出中止和异染色质化来限制对脆弱DNA的接触；因此，相同的三维机器根据损伤来源的不同被部署于截然相反的方向。

癌症基因组数据进一步印证了其临床相关性：BRCA1或BRCA2缺陷肿瘤中的突变优先积累在环体之外，而含有环的CTCF结合位点锚点在HR缺陷肿瘤中显示出较高的突变频率，提示当经典通路受损时，细胞可能更依赖这一结构性备份机制。

该通路仍有几个有趣的问题未得到解决。正如作者所强调的，环挤出马达的身份尚不明确。凝缩蛋白是可能的候选者，其在组织经典的CTCF锚定环中已有已知作用，但SMC5/6和凝聚素（Condensin）复合物仍是可行的替代方案。同样，并非每一个CTCF结合且复制叉停滞的热点位点都会成熟为稳定的环，暗示着其他尚未定义的活动。

异染色质形成是否独立于环形成而为逆转复制叉提供保护，尚不清楚，而这些作用之间的遗传学解析也颇具挑战性。同样引人注目的是ATR与CTCF之间的机制交互，以及它们与其他活动（如PAR基化）之间可能存在的串扰。

总体而言，这项研究为复制叉保护领域增添了新的、重要的维度：一个快速组装且快速可逆的染色质环支架，独立于BRCA状态来屏蔽受应激的复制域。鉴于其对缺乏BRCA1或BRCA2的HR缺陷肿瘤基因组的意义，理解如何调控这一结构，并探索肿瘤是否对其产生依赖性，是一个自然的下一步工作，这对基因组不稳定性研究和依赖复制应激的癌症治疗均具有重要意义。