杜鹃花叶龄对黄酮类化合物组成、人胰脂肪酶抑制活性及卤虫致死性的影响：以阿达姆斯杜鹃叶片与萨甘达利茶为研究对象

《Foods》：Age-Related Variation in Flavonoid Composition, Human Pancreatic Lipase Inhibition, and Preliminary Brine Shrimp Lethality of Rhododendron adamsii Leaves and Sagan Dali Tea

　　

中文翻译：阿达姆斯杜鹃（Rhododendron adamsii Rehder）是亚洲重要的杜鹃花科（Ericaceae）物种，广泛用作生产萨甘达利茶（sagan dali tea）的食用植物。尽管R. adamsii叶片在不同发育阶段均被食用，但其代谢物组成及生物活性的潜在差异尚未得到科学研究。为填补这一知识空白，研究人员对一年生叶片、二年生叶片及凋落叶（litterfall）分别制备水煎液（decoction），采用液相色谱-质谱联用（LC–MS）进行轮廓分析与定量，开展人胰脂肪酶（human pancreatic lipase, hPL）抑制活性体外测定，并利用卤虫致死性（brine shrimp lethality, BSL）试验进行毒性评价。结果表明，叶片年龄显著影响（p < 0.05）萨甘达利茶中酚类化合物多样性、总含量及抗脂肪酶活性，其性能排序为：一年生 > 二年生 > 凋落叶。叶片衰老导致黄酮苷含量下降或消失，同时游离苷元含量增加，最终改变茶的化学组成。具体而言，一年生叶片中的主要化合物为杨梅素3′-O-木糖苷（myricetin 3′-O-xylopyranoside，881–917 mg/100 g）和槲皮素3-O-半乳糖苷（quercetin 3-O-galactoside，672–714 mg/100 g），而凋落叶中则以游离杨梅素（myricetin，427–451 mg/100 g）为主。萨甘达利茶的最高抗脂肪酶效力见于一年生叶片（IC50 30.65–33.47 μg/mL，对比奥利司他（orlistat）35.28 μg/mL）。该活性与杨梅素、槲皮素及棉皮素（gossypetin）的游离态和糖苷态形式相关，其IC50值在测试条件下均低于奥利司他。此外，BSL试验显示LC50值 > 1000 μg/mL，表明在测试条件下萨甘达利茶对卤虫的致死性较低。然而，这些结果仅提供初步信息，尚不能确立其食用或人体安全性。综上，R. adamsii叶片的年龄是决定植物化学成分浓度及相关生物活性的关键参数，同时在测试条件下始终保持较低的卤虫致死性。这些发现为R. adamsii叶片材料的最佳利用提供了生化基础。

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研究背景与问题

杜鹃花属（Rhododendron）植物在亚洲、欧洲和北美广泛分布，长期以来被用作传统药物和观赏植物，其叶片和花朵也用于生产花草茶。阿达姆斯杜鹃（Rhododendron adamsii Rehder）是亚洲重要的杜鹃花科物种，其叶片是制作萨甘达利茶（sagan dali tea）的主要原料，占商业杜鹃花茶市场的90%以上。萨甘达利茶位列北亚十大无咖啡因花草茶之列。然而，R. adamsii叶片在不同发育阶段被采收，包括一年生叶片、二年生叶片和凋落叶，这些不同叶龄材料的代谢物组成和生物活性差异此前从未被系统研究。叶片年龄可能通过代谢物的积累、利用和转化显著影响植物组织的化学成分，进而影响茶的风味特征和生物活性。此外，尽管R. adamsii被传统用于治疗脂质代谢紊乱如肥胖和动脉粥样硬化，但其对人胰脂肪酶（hPL）的抑制作用尚未得到评估。安全性方面，早期曾有关于杜鹃花属植物含有木藜芦毒素（grayanotoxin）的报道，但后续研究未能证实R. adamsii中存在该毒素，且缺乏系统的毒性评价。因此，本研究旨在系统表征不同叶龄R. adamsii叶片的酚类化合物谱和抗脂肪酶活性，并利用卤虫致死性（BSL）试验进行初步毒性评估。

研究内容与结论

研究人员收集了2021至2023年连续三年在萨哈共和国采集的一年生、二年生R. adamsii叶片及凋落叶，每个采样年份从三个地理位点采集，每个位点1000片叶子混合为单一复合样本，提供三个独立生物学重复。研究通过LC–MS profiling和定量分析、hPL抑制活性测定以及BSL毒性评价，系统评估了叶龄对萨甘达利茶化学成分和生物活性的影响。结果表明，叶片年龄显著影响酚类化合物多样性、总含量和抗脂肪酶活性，性能排序为一年生 > 二年生 > 凋落叶。叶片衰老导致黄酮苷含量下降或消失，游离苷元增加。一年生叶片中主要化合物为杨梅素3′-O-木糖苷和槲皮素3-O-半乳糖苷，而凋落叶中游离杨梅素占主导。最高抗脂肪酶效力见于一年生叶片（IC₅₀ 30.65–33.47 μg/mL），优于阳性对照奥利司他（35.28 μg/mL）。BSL试验显示所有样品的LC₅₀值均大于1000 μg/mL，表明低卤虫致死性。

关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：快速微柱高效液相色谱-光电二极管阵列-四极杆飞行时间质谱联用技术（Fast MC-HPLC-PDA-Q-TOF-MS）用于叶片和茶汤中酚类化合物的定性与定量分析；超声辅助提取（UAE）制备甲醇提取物；水煎煮法制备萨甘达利茶汤并冻干获得干提取物；体外分光光度法测定人胰脂肪酶（hPL）抑制活性，以对硝基苯基硬脂酸酯为底物，奥利司他为阳性对照；卤虫致死性试验（BSL）评估急性毒性，采用概率单位回归分析确定LC₅₀值；三因素方差分析（ANOVA）和Fisher最小显著差数（LSD）检验进行统计分析，Pearson相关分析评估黄酮含量与抑制活性的关系。

研究结果

不同叶龄R. adamsii叶片中的酚类化合物。 通过LC–MS分析，一年生叶片检出25种化合物，二年生叶片检出24种，凋落叶仅检出14种。所有样品均含有苯甲酸类、羟基肉桂酸类和黄酮类化合物。黄酮类包括黄酮醇（棉皮素、杨梅素、5-O-甲基杨梅素和槲皮素衍生物）和二氢黄酮醇（花旗松素和香橙素衍生物）。棉皮素3-O-阿拉伯糖苷和棉皮素3-O-戊糖苷仅存在于一年生和二年生叶片中，凋落叶中消失；杨梅素3-O-半乳糖苷和杨梅素3-O-(6″-O-苯甲酰)-半乳糖苷在凋落叶中缺失。

不同叶龄R. adamsii叶片中酚类化合物含量。 黄酮类化合物是含量最丰富的酚类，一年生叶片总黄酮含量达4081–4219 mg/100 g，二年生叶片为2706–2963 mg/100 g，凋落叶仅为1043–1107 mg/100 g。黄酮醇含量远高于二氢黄酮醇。糖苷与苷元比值从一年生叶片的15.5–17.8:1降至凋落叶的0.9–1.1:1，表明叶片衰老过程中糖苷逐渐水解为游离苷元。一年生叶片的主要化合物为杨梅素3′-O-木糖苷（881–917 mg/100 g）和槲皮素3-O-半乳糖苷（672–714 mg/100 g），凋落叶中游离杨梅素（427–451 mg/100 g）占主导。

黄酮类化合物从R. adamsii叶片向萨甘达利茶汤的转移。** 研究人员比较了0.5、1.0和2.0 g/100 mL三种投料量制备的茶汤。高投料量组黄酮含量更高。一年生叶片2.0 g/100 mL投料量茶汤的总黄酮含量为62,803 μg/100 mL。黄酮回收率方面，一年生叶片总黄酮回收率为72–77%，二年生为52–59%，凋落叶仅为24–31%。一年生叶片中12种化合物在多种投料条件下回收率超过80%，而凋落叶中无化合物达到该水平。

萨甘达利茶汤的人胰脂肪酶抑制潜力。 九种R. adamsii叶片水煎液干提取物的IC₅₀值为30.65–123.63 μg/mL。一年生叶片2.0 g/100 mL提取物（IC₅₀ 30.65 μg/mL）和1.0 g/100 mL提取物（IC₅₀ 33.47 μg/mL）的IC₅₀值低于奥利司他（35.28 μg/mL）。Pearson相关分析显示总黄酮含量与hPL抑制潜力呈显著负相关（r = ?0.918，R² = 0.8421，p ≈ 4.8 × 10^?4）。对20种黄酮化合物的测试表明，杨梅素（IC₅₀ 8.38 μg/mL）、槲皮素（IC₅₀ 12.34 μg/mL）和棉皮素（IC₅₀ 8.02 μg/mL）的抑制活性最强。糖基化修饰普遍降低抑制活性，而酰化修饰对活性的影响因化合物而异。

萨甘达利茶汤的卤虫致死性毒性评价。 BSL试验中，所有R. adamsii提取物在最高测试浓度1000 μg/mL下死亡率不超过10%，LC₅₀值均大于1000 μg/mL，根据Meyer毒性指数归类为低卤虫致死性。阳性对照环磷酰胺的LC₅₀为12.5 μg/mL。绿茶（LC₅₀ 755 μg/mL）和红茶（LC₅₀ > 1000 μg/mL）作为传统茶饮对照，绿茶毒性高于萨甘达利茶，可能与其含有的咖啡因有关。

讨论与结论

讨论部分指出，R. adamsii叶片衰老过程中黄酮苷逐渐水解为苷元，可能源于水解过程速率增加，也可能涉及淋溶、氧化、微生物活动和落叶后降解。萨甘达利茶的黄酮含量（15–63 mg/100 mL）接近绿茶汤的水平。抗脂肪酶活性与黄酮含量高度相关，杨梅素、槲皮素和棉皮素及其糖苷是主要的候选活性成分，但体外酶抑制并不直接等同于临床疗效。BSL试验仅提供初步急性毒性信息，不能替代哺乳动物模型的全面毒理学评价。研究结论为：叶片年龄显著影响R. adamsii的黄酮含量和生物活性，一年生叶片黄酮水平最高（3833–3992 mg/100 g），hPL抑制效力最强（IC₅₀ 30.65–33.47 μg/mL），与奥利司他相当。黄酮类化合物（杨梅素、槲皮素、棉皮素及其糖苷）是主要候选活性成分。所有样品在BSL试验中均显示低卤虫致死性。研究为R. adamsii采收者和萨甘达利加工者选择最佳叶龄以最大化生物活性提供了生化依据，但需通过体内啮齿动物模型和生物活性导向分馏进一步确认功效和安全性。