低温改性气调运输过程中鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）肌肉微生物群落演替及其环境响应

《Foods》：Microbial Community Succession and Its Environmental Response in Bighead Carp (Hypophthalmichthys nobilis) Muscle During Low-Temperature Modified Atmosphere Transportation

　　

微生物群落演替 contributes to 冷链运输过程中新鲜淡水鱼的质量变化。本研究以鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）为研究材料，利用16S rRNA高通量测序技术，表征了在低温（0 °C、4 °C、8 °C）与梯度CO₂气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）联合处理下，模拟运输12 h和24 h后鱼肉肌肉组织中微生物群落动态，并进一步识别了冷链物流过程中与细菌群落变化关联的关键环境因子。结果表明，运输温度是塑造鳙鱼肌肉微生物群落的首要因子，其作用强于MAP气体组成和运输时长。在8 °C温度条件下，低至中等浓度CO₂ MAP对应更高的微生物多样性和腐败相关演替，同时富集了包括假单胞菌属（Pseudomonas）在内的腐败菌群。高浓度CO₂（80%）MAP在低温条件下改变了群落组成并降低了群落复杂性，且群落变化在延长运输过程中呈现时间依赖性模式。0 °C与80% CO₂ MAP联合处理在24 h内产生了独特的微生物演替特征，并降低了假单胞菌属的相对丰度。本研究描述了鳙鱼肌肉微生物群对低温与MAP耦合处理的响应模式，并表征了冷链运输过程中的群落演替特征。研究结果为理解淡水鱼冷链物流中的微生物变化提供了基于微生物群落的参考依据。

论文解读：低温与梯度CO₂气调包装耦合下鳙鱼肌肉微生物群落演替及其环境驱动机制

一、研究背景与问题

水产养殖是全球增长最快的食品产业之一，为人类提供多种必需营养素。中国是世界第一大水产养殖国，淡水养殖体系完善、产量巨大。鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）作为我国重要的大宗淡水经济鱼类，年产量稳定在300至350万吨。然而，鳙鱼主产区集中于长江和珠江流域，生产和消费区域高度重叠，跨区域和长距离流通面临显著瓶颈。鳙鱼肉水分和蛋白质含量高、质地嫩滑、内源代谢酶活跃，在冷链贮藏和运输过程中极易受温度波动等环境扰动影响，诱发微生物群落变化并加速肉质劣变。其货架期短、运输稳定性差，严重制约了鳙鱼的商业化流通和产业高质量发展。

气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）是一种安全、物理性保鲜技术，通过置换包装内空气并重构气体比例，改变食品基质的微生物群落动态和氧化变化。CO₂是MAP中抑制大多数腐败微生物的核心气体组分，N₂作为惰性填充气体维持包装形态并缓解脂质氧化，O₂用于保持鲜肉色泽但过量会加速氧化并促进需氧腐败菌生长。低温与MAP联合应用是水产品保鲜的有效策略，但温度与气体组成并非独立作用，二者存在复杂交互效应。已有关于鳙鱼微生物演替的研究多集中于静态冷藏和非气体保鲜干预，如恒定4 °C下轻盐鳙鱼片微生物群落变化、ε-聚赖氨酸处理鳙鱼片冷藏过程中的菌相变化、石榴皮提取物对鳙鱼片冷藏品质和微生物组成的影响等。这些研究均基于恒温贮藏场景或化学/生物保鲜方法，对不同冷链运输温度与梯度CO₂ MAP联合作用下的微生物群落动态仍缺乏系统认识。实际冷链运输中，不同温度如何与梯度CO₂浓度耦合调控微生物群落结构、腐败相关菌群演替及群落分化，温度-CO₂联合处理下微生物的交互响应特征和时间依赖性变化规律尚未被系统阐明，限制了淡水鱼物流MAP参数的精细化和标准化。16S rRNA高通量测序能够全面解析生鲜食品中微生物群落组成、类群相对丰度和演替动态，为研究低温与MAP联合条件下的微生物群落变化提供了有力工具。

二、研究内容与主要结论

本研究以鳙鱼为对象，模拟实际商业冷链运输条件，设置3个温度水平（0 °C、4 °C、8 °C）、3种梯度CO₂ MAP配方（A：40% CO₂+10% O₂+50% N₂；B：60% CO₂+10% O₂+30% N₂；C：80% CO₂+10% O₂+10% N₂）和2个运输时长（12 h、24 h），采用三因素实验设计开展模拟冷链贮运。研究人员利用16S rRNA V3–V4区高通量测序，解析了肌肉微生物群落的多样性、结构、优势菌群演替及预测功能，并结合冗余分析（redundancy analysis，RDA）、Spearman秩相关分析等方法识别驱动群落分化的关键环境因子。

研究得出以下主要结论：运输温度是构建鳙鱼肌肉微生物群落的首要因子，其效应强于MAP气体组成和运输时长；8 °C下低至中等浓度CO₂ MAP对应更高的微生物多样性和腐败相关演替，富集了假单胞菌属（Pseudomonas）等腐败菌群；高浓度CO₂（80%）MAP在低温条件下改变群落组成并降低群落复杂性，且这种效应具有时间依赖性；0 °C与80% CO₂联合处理在24 h内形成独特的微生物演替特征，并显著降低假单胞菌属相对丰度。该研究首次系统描述了鳙鱼肌肉微生物群对温度-CO₂耦合处理的响应模式，为淡水鱼冷链物流MAP工艺优化提供了微生物学依据。

三、主要关键技术方法

研究人员从重庆长寿湖获取54尾健康鳙鱼（平均体重1.5±0.2 kg），在实验室循环水系统中驯化24 h后，以100 mg/L MS-222麻醉，无菌条件下采集背部及侧部肌肉，切成5.0 cm×8.0 cm×3.0 cm、每块120±5.0 g的均匀肉块，分别密封于聚乙烯袋中。所有动物操作符合四川农业大学实验动物福利与伦理委员会要求（伦理批号20230634）。采用三因素实验设计模拟冷链运输，所有样品置于校准的便携式控温运输箱中，温度波动维持在±0.5 °C内，处理后立即于?80 °C冻存。总微生物DNA使用TIANamp Genomic DNA kit提取，PCR扩增16S rRNA基因V3–V4区（引物338F/806R），产物经胶回收纯化后构建NEXTFLEX文库，在Illumina NextSeq 2000平台完成高通量测序。原始序列经FLASH合并、FASTP质控，以97%相似度用Vsearch聚类OTU，基于Silva v138.2数据库进行物种注释。采用QIIME 2和R软件计算α多样性和β多样性，通过PCoA、UPGMA聚类、Kruskal–Wallis H检验、RDA和PICRUSt2功能预测解析群落与环境因子的关系。统计分析使用GraphPad Prism 10.3.0完成。

四、研究结果

1. 温度-MAP联合处理下的微生物群落结构

稀释曲线和物种累积曲线表明测序深度和样本量充分。基于加权UniFrac距离的UPGMA聚类和主坐标分析（PCoA）显示，样本并未按温度或运输时长一致聚类，C412和C824形成远离主簇的分支；PC1和PC2分别解释总变异的36.60%和14.92%，C024、C424也存在分散。结果表明CO₂浓度可能对部分样本分离有贡献，而温度和运输时长与样本分组的关联较弱。门水平上，假单胞菌门（Pseudomonadota）为绝对优势门，平均相对丰度达82.13%，包括假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和气单胞菌属（Aeromonas）等嗜冷腐败菌；拟杆菌门（Bacteroidota）、芽孢杆菌门（Bacillota）、放线菌门（Actinomycetota）和异常球菌门（Deinococcota）为其他主要类群。

2. 微生物群落变化的环境驱动因子

RDA分析中RDA1和RDA2分别解释43.27%和31.23%的群落变异，累计74.50%。箭头长度显示运输时长与明显组成差异相关，温度是三个温度水平下与整体群落结构关联最强的因子；在相同温度内，CO₂区分不同MAP处理，而N₂效应可忽略。Spearman热图显示温度与observed species、Chao1和ACE指数强正相关（p<0.01），CO₂与α多样性指数负相关，运输时长和N₂无显著相关。这表明温度主导不同贮藏条件下微生物群落结构和丰富度的塑造，CO₂是相同温度下区分MAP处理的核心变量。

3. 温度-MAP联合处理下肌肉微生物群α多样性

observed species和Shannon指数变化趋势一致，8 °C波动温度下多样性升高、群落复杂化，0 °C样品多样性较低。80% CO₂与0 °C联合处理在所有组中产生最低的observed species和Shannon值。OTU计数分析显示，0 °C下12 h时OTU数未随CO₂浓度升高而降低，C012样品仍有501个OTU；24 h时C024的OTU数降至155，显著低于同时间点A组和B组。这说明80% CO₂对群落丰富度的抑制作用存在时间滞后效应，需持续暴露24 h才能产生可检测的群落变化。

4. 属水平差异类群与腐败相关细菌群落变化

Kruskal–Wallis H检验显示，0 °C下12 h时C012组假单胞菌属相对丰度高于A012和B012，说明高浓度CO₂短期暴露未降低该属丰度；24 h时C024中假单胞菌属相对丰度下降并低于A024和B024，再次证实时间滞后效应。8 °C条件下12 h时各组假单胞菌属相对丰度均高于对应0 °C样品，即使80% CO₂处理也未能抵消温度升高带来的假单胞菌属增加；24 h时金黄杆菌属（Chryseobacterium）、谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）和短波单胞菌属（Brevundimonas）成为主要差异类群，优势腐败菌发生更替，群落趋于腐败相关特征趋同。这表明温度波动是驱动腐败菌群更替和群落趋同的主导因素，单纯CO₂调节难以对抗温度变化引起的群落转型。

5. 微生物群落功能预测

PICRUSt2功能预测显示，温度对预测功能谱的影响大于MAP处理。8 °C条件下与细菌生长、蛋白水解和脂质降解相关的预测功能丰度更高，0 °C与80% CO₂联合处理则降低了这些腐败相关功能类别的预测丰度。功能预测结果与群落结构、α多样性和腐败菌群变化趋势基本一致，但作者强调这些结果为基于16S rRNA测序的计算推断，并非直接实验测定，不能反映原位代谢活性或区分活菌/死菌信号。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，运输时长对微生物群落结构的影响通常小于温度和气体组成，本研究结果与之一致。温度通过改变微生物代谢速率重塑群落组成，CO₂则通过胞内酸化和膜损伤抑制腐败菌生长。在生产实践中广泛使用的40–60% CO₂配方在稳定低温下仅引起有限的群落变化，但在不同温度条件下其约束群落变化的能力减弱；80% CO₂配方表现出一定的抗温度扰动能力，且低温-高CO₂联合与微生物多样性降低相关。高CO₂效应的温度依赖性和时间滞后性，部分解释了商业MAP应用中效果不一致的现象。

研究结论为：0 °C与80% CO₂联合处理在24 h模拟运输后产生独特的微生物群落特征、更低的群落复杂性和降低的腐败相关假单胞菌属相对丰度。微生物对高CO₂的响应具有时间和温度依赖性，显著的群落改变仅在稳定低温条件下出现。8 °C高温重塑了微生物演替轨迹，增加微生物多样性并促使优势腐败类群更替。40%和60% CO₂ MAP在温度变化条件下引起的微生物群落改变可忽略，且在不同温度条件下表现出保鲜效应。温度是模拟冷链运输中驱动微生物群落变化的主导环境因子，CO₂介导的微生物调控效应在稳定低温条件下最为显著。研究补充了淡水鱼冷链物流中微生物群落动态的基础信息，但结论仅源于16S rRNA测序数据，后续需整合理化指标、感官品质及多组学数据，以全面评价温度-CO₂联合MAP处理在鳙鱼冷链保鲜中的实际应用价值。