黄酮醇靶向疾病相关口腔细菌类群的差异调控作用研究

《Nutrients》：Targeting of Oral Bacterial Taxa Linked to Disease by Flavonols

　　

**背景：**不同细菌类群形成的网络共同维系着口腔健康。理想的抗菌制剂应当能够选择性地调控与疾病相关的细菌亚群。已有研究证实，植物来源的天然化合物可抑制浮游细菌或单菌种口腔生物膜的生长，然而，针对这些抗菌剂在人体口腔内原生生物膜（native biofilms）中作用的体内研究仍十分匮乏。本研究旨在检测候选抗菌剂在复杂生物膜体系中对特定细菌类群的影响能力。**方法：**研究人员从供体收集口腔生物膜（oral biofilms）样本，取样自唾液并经快速处理后用于多酚（polyphenol）检测。随后，样本与待测多酚共孵育4小时。通过下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）cDNA测序检测16S rRNA表达水平，以确定细菌抑制的潜在靶标。**结果：**两种黄酮醇（flavonols），即山柰酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin），对总RNA水平具有较小的抑制作用；而杨梅素（myricetin）在较高测试浓度（1 mM）下表现出显著的抑制效果。对整体微生物群体结构的影响（以口腔生物膜16S rRNA的α多样性为指标）甚微。值得注意的是，黄酮醇特异性降低了与牙周病和心血管疾病均相关的口腔细菌物种的rRNA水平，同时对多种共生菌类群无明显影响。**结论：**综上所述，植物来源的黄酮醇是选择性抗菌化合物的潜在来源，可针对口腔病原菌及可能促成全身性疾病的相关细菌发挥作用，同时将整体细菌活性水平的干扰降至最低。

**一、研究背景与科学问题**

口腔微生物组是人体内最大且最复杂的宿主共生环境之一，栖息着超过七百个分类群，形成由多种微生物群落组成的动态生态系统。这些细菌并非孤立存在，而是通过多菌种生物膜形成相互关联的网络结构，能够粘附于牙齿和上皮表面。在这些生物膜内部，物种间的协同互作（如营养交叉喂养）以及拮抗行为（如竞争）共同塑造了微生物生态系统。同时，这些微生物网络不断面临来自饮食、唾液、口腔卫生习惯、咀嚼行为以及外源病原体竞争等环境压力。因此，口腔健康取决于常驻微生物群落与宿主之间的稳态平衡。一旦这些细菌网络被破坏，便可能引发菌群失调（dysbiosis），进而导致牙周炎、龋齿、牙龈炎甚至癌症等口腔疾病。此外，口腔微生物组的状况还可能通过口腔-脑轴和口腔-肠道轴影响全身健康，口腔细菌或其产物可易位至远端器官，与动脉粥样硬化等心血管疾病及阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关联。

黄酮醇（flavonols）是多酚家族的重要成员，广泛存在于水果和蔬菜中，其结构特征为酚环C3碳上的羟基，并具有不同的甲基化和羟基化模式。除抗氧化特性外，黄酮醇还具备明确的抗菌特性。已有体外研究表明，杨梅素、槲皮素和山柰酚等黄酮醇对牙周病和龋齿相关细菌具有抑制作用，例如对牙周关键病原菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）具有显著抑制效果。然而，绝大多数研究集中于肠道菌群，针对黄酮醇对人体口腔原生复杂生物膜中特定菌种的体内或外体调控作用仍缺乏系统性证据。因此，本研究提出假设：多酚能够调控口腔细菌网络中的一个亚群，且总体效应与健康维护方向相符。

**二、研究目的与实验设计**

本研究旨在利用脱落唾液生物膜（shed saliva biofilm）离体试验体系，系统评估三种结构相近但酚羟基数目不同的黄酮醇——杨梅素、山柰酚和槲皮素——对口腔复杂生物膜中细菌类群的特异性靶向作用。该试验体系利用口腔生物膜以大规模聚集体形式脱落进入唾液这一自然现象，这些细菌聚集体在口腔表面进行循环附着与脱附，相较于人工构建的体外系统，能够更真实地模拟体内完整生物膜状态。

**三、关键技术与方法**

研究采用的主要技术方法包括：（1）基于脱落唾液生物膜的外体培养试验体系，生物膜样本采集自两组独立供体（第一批10人，年龄20-67岁含4名女性；验证组6人，年龄19-35岁含4名女性），供体均身体健康，近3个月未使用抗生素且无吸烟史，采样前24小时被告知暂停口腔清洁，样本经刺激后收集并在厌氧条件下（5% CO₂、10% H₂、85% N₂）于37°C与各黄酮醇共孵育4小时；（2）16S rRNA基因扩增子测序分析，提取总RNA后经逆转录合成cDNA，针对细菌16S rRNA基因V1–V3高变区进行PCR扩增和Illumina MiSeq双端测序（2×300 bp）；（3）生物信息学分析，使用QIIME2（v 2026.4）进行序列降噪（DADA2）及分类学注释（BLAST+比对至人类口腔微生物组数据库），利用MicrobiomeAnalyst评估α和β多样性（PERMANOVA），并采用多变量关联线性模型（Multivariate Association with Linear Models, MaAsLin3版本1.2.0）进行差异丰度分析，以处理类型/浓度为固定效应、供体编号为随机效应，使用Benjamini-Hochberg方法校正多重检验。

**四、研究结果**

**（1）黄酮醇对总RNA水平的差异性抑制**

在400 μM和1 mM两个浓度下，杨梅素在1 mM浓度下表现出最显著的RNA抑制效果。与阴性对照组（仅含载体）相比，各种黄酮醇处理均使总RNA水平出现不同程度降低，但高浓度杨梅素处理造成了最大幅度的RNA水平下降，表明其对细菌整体转录活性的影响最为强烈。

**（2）三种黄酮醇的效果强度比较**

效应量分析显示，杨梅素在400 μM和1 mM浓度下均具有最大的平均和中位数绝对效应量。Friedman秩和检验表明三种黄酮醇的效应量幅值存在显著差异（400 μM: χ2 = 7.31, df = 2, *p*-val = 0.0258; 1 mM: χ2 = 68.02, df = 2, *p*-val = 1.70×10?1?）。事后Wilcoxon符号秩检验进一步显示，杨梅素与山柰酚及槲皮素之间均存在显著差异。

**（3）黄酮醇富集的细菌类群**

在两组独立供体的验证试验中（FDR<0.1对应第一批，FDR<0.05对应验证批），研究人员鉴定出多个被黄酮醇抑制16S rRNA水平的细菌类群。这些细菌包括与牙周疾病相关的中间普雷沃菌（*Prevotella intermedia*）、微小微单胞菌（*Parvimonas micra*）、咽峡炎链球菌（*Streptococcus anginosus*）和中间链球菌（*Streptococcus intermedius*）等，以及与心血管疾病关联的口腔菌群中的多个分类群。有趣的是，部分与健康相关的共生菌（如唾液链球菌（*Streptococcus salivarius*）、黏膜奈瑟菌（*Neisseria mucosa*）、奇异劳特罗普菌（*Lautropia mirabilis*）和婴儿链球菌（*Streptococcus infantis*））的16S rRNA相对水平在黄酮醇存在下反而有所升高。

**（4）α多样性与β多样性的影响**

对各黄酮醇处理后菌群α多样性进行了检测：仅1 mM杨梅素处理组中的Chao1丰富度指数显著升高（*p* < 0.00468，FDR < 0.0281）；Shannon多样性指数在0.4 mM杨梅素处理后亦出现显著差异（*p* < 0.0027，FDR < 0.0160）。其余浓度和处理未对α多样性产生显著影响。β多样性方面（Bray–Curtis距离），PERMANOVA分析结果显示杨梅素在400 μM和1 mM浓度处理下均与对照组相比差异显著（FDR < 0.003），而山柰酚两组浓度均未表现出显著效应，槲皮素仅在400 μM出现边缘显著差异（FDR < 0.057）。

**（5）动脉粥样硬化关联菌群的调控**

针对已报道与动脉粥样硬化相关的17种口腔菌群，共有7种在供体中丰度达到可分析水平。其中4种菌（具体为*P. micra*、*S. anginosus*、*S. intermedius*和另一菌种）在两组试验中均被一种或多种黄酮醇在rRNA水平上显著抑制，且未发现任何动脉粥样硬化相关菌群的16S rRNA相对水平呈现升高趋势。

**五、讨论与结论**

研究发现，三种黄酮醇类化合物（杨梅素、山柰酚和槲皮素）在脱落口腔生物膜的外体试验中对细菌类群的影响方向大体类似，然而在活性强度方面呈现出显著差异，其中杨梅素的活性最强。这一发现提示分子结构中的酚羟基数目可能是影响抗菌活性的关键因素，高反应性或高溶解度、以及细菌酶参与的化合物代谢等因素均可能造成这种活性差异。被抑制细菌类群中，绝大多数（12/13）为革兰氏阳性菌，且以厌氧菌为主（3种严格厌氧，10种兼性厌氧），而富集细菌中则包含2种需氧菌。在疾病关联分析中，与动脉粥样硬化及口腔疾病相关的细菌被抑制的比例明显更高，而试验中鉴定为富集的细菌类群中没有一种与口腔疾病相关，其中还包括了公认的对健康有益的细菌。值得注意的是，总体RNA浓度虽然下降，但菌群α多样性的变化却非常有限，这表明抑制效果主要集中在了丰度较高的特定细菌中，而并非对整个微生物群落的整体活性与结构造成了广泛性的破坏。这些外体试验结果提示，植物来源的黄酮醇有望作为一类选择性抗菌化合物，以针对口腔病原菌和可能促进全身性疾病的相关细菌发挥效用，同时将对整体菌群活性水平的扰动控制在极低程度。然而，这些发现能否在体内条件下再现，以及对于人体黄酮醇摄入需要达到何种水平，仍有待于未来在更大人群和不同剂量条件下进行系统研究。尽管如此，此类化合物在开发用于口腔保健的牙香糖或含片等缓释递送系统中，作为靶向调控口腔菌群、预防及管理相关疾病的辅助策略，显示出了积极的应用潜能。

综上所述，本研究的核心结论可概括为：三种被检测黄酮醇（myricetin、kaempferol和quercetin）对口腔细菌类群的作用范围高度重叠，但在抑制强度上存在等级差异，以myricetin的效应最为显著；在动脉粥样硬化和口腔疾病的关联菌群实例中，疾病相关细菌被黄酮仁抑制的频率要明显高于有益健康菌群，但这些外体实验结果是否能够向体内转化，以及所需黄酮醇摄入量的具体水平，仍属有待后续研究解答的关键科学问题。