《International Journal of Molecular Sciences》：Low-Dose Glyphosate Exposure Alters the Enteric Tachykinin System in the Porcine Small Intestine
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草甘膦（Glyphosate）是一种广泛使用的除草剂，然而其对肠神经系统（enteric nervous system, ENS）的影响仍知之甚少。本研究探讨了低剂量草甘膦暴露对猪小肠中P物质（substance P, SP）免疫反应阳性神经元及
专业摘要翻译
草甘膦（Glyphosate）是一种广泛使用的除草剂，然而其对肠神经系统（enteric nervous system, ENS）的影响仍知之甚少。本研究探讨了低剂量草甘膦暴露对猪小肠中P物质（substance P, SP）免疫反应阳性神经元及速激肽受体基因表达的影响。15头幼猪被分为三组（每组n = 5）：对照组及两个口服草甘膦28天的处理组，给药剂量分别对应欧洲预估最大每日摄入量（0.05 mg/kg BW/天）和可接受每日摄入量（acceptable daily intake, ADI；0.5 mg/kg BW/天）。采用双重免疫荧光法测定十二指肠、空肠和回肠的肌间神经丛（myenteric plexus, MP）、外黏膜下神经丛（outer submucosal plexus, OSP）和内黏膜下神经丛（inner submucosal plexus, ISP）中SP免疫反应阳性神经元的百分比。通过RT-qPCR分析TACR1、TACR2和TACR3的表达。草甘膦暴露增加了所有被分析肠段和神经丛中SP免疫反应阳性神经元的百分比，且呈现明显的剂量相关模式。在两个草甘膦暴露组的十二指肠中，TACR2 mRNA表达显著升高，但在较高草甘膦剂量组的回肠中则显著降低。两个暴露组十二指肠中TACR3 mRNA表达显著降低，较高剂量组空肠中亦显著降低，而TACR1表达保持不变。在暴露于较高草甘膦剂量组的猪的十二指肠和回肠中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性显著升高，而空肠中未见显著变化。这些发现表明，低剂量草甘膦暴露与肠速激肽系统特定组分的区域特异性改变相关，提示ENS对草甘膦存在复杂的神经化学响应。
论文解读
一、研究背景与目的
草甘膦是一种合成非选择性除草剂，是草甘膦类除草剂（glyphosate-based herbicides, GBH）中的活性成分，广泛用于农业杂草防控。该化合物属于膦酸酯类，水溶性极高，既便于喷雾施用，也促进了其在环境中的扩散。因此，草甘膦在土壤、地表水、地下水、大气降水及某些食品中均有检出。草甘膦的作用机制涉及抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），该酶是莽草酸途径中的关键酶，负责植物和某些微生物中芳香族氨基酸的生物合成。草甘膦最初被认为对脊椎动物相对安全，因为动物细胞缺乏该代谢途径。然而，目前越来越多的研究关注到许多定植于动物体内（包括肠道菌群）的细菌和真菌中存在莽草酸途径，这可能是草甘膦间接影响宿主的机制之一。此外，文献已描述暴露于草甘膦或GBH后在细胞和组织水平发生的多种变化，包括肝肾功能紊乱、氧化应激增强及炎症反应改变等。关于致癌和神经毒性作用的报告仍部分存在争议，很大程度上取决于研究模型、剂量和制剂组成。同时，实验研究已证实草甘膦及某些GBH制剂能够诱导神经毒性变化，包括神经元传递紊乱、神经炎症和氧化应激。
越来越多的研究聚焦于草甘膦对胃肠道的影响。动物模型已证明，暴露于该化合物可改变肠道菌群组成，包括潜在有益菌群的减少和具有促炎潜力的微生物相对增加。这些变化可能伴随肠道屏障完整性减弱，表现为紧密连接蛋白表达降低和肠黏膜局部炎症反应增强。除上皮和菌群外，肠神经系统（enteric nervous system, ENS）是对胃肠道稳态紊乱作出响应的重要组分。ENS是由神经元和胶质细胞组成的广泛网络，能够自主控制运动、分泌、血流和肠道屏障功能，同时与免疫系统和上皮细胞密切交互，整合机械、化学和炎症信号。在损伤、炎症或毒物暴露时，ENS可能发生神经化学重塑，涉及神经递质和神经肽表达谱的变化而无显著神经元丢失。这一现象被视为ENS可塑性的表现，既反映适应性机制，也反映神经元功能障碍的早期阶段。
在ENS神经肽中，速激肽被认为尤为重要，因为它们将肠道运动调节与神经免疫机制联系起来。P物质（substance P, SP）是肠壁内感觉信号传导和神经源性炎症的主要介质之一，可促进免疫活性细胞活化、调节微血管通透性，并可能增强肠黏膜局部炎症反应。既往研究表明，肠神经元神经化学表型可能响应功能性及炎症性胃肠疾病、丙烯酰胺或双酚A等毒物暴露、以及链脲佐菌素诱导的糖尿病等代谢紊乱而发生改变。SP主要通过G蛋白偶联受体——神经激肽1（NK1）受体发挥生物学效应，该受体在调节胃肠道壁内的感觉传导和炎症机制中发挥重要作用。SP在较小程度上也可与NK2和NK3受体相互作用，后者调节平滑肌层活性和肠神经系统局部神经网络中的信号处理。
猪胃肠道在解剖和功能上与人类具有显著相似性，包括肠壁各层结构相当和ENS发育完善。该物种ENS的神经化学组织已被详细表征，适合评估肠神经元神经化学表型对毒性和炎症刺激的响应变化。因此，猪被认为是胃肠道病理生理转化研究的重要模型。尽管关于草甘膦及GBH对肠道菌群和肠道屏障完整性影响的研究日益增多，且已有报道提示草甘膦暴露可能改变猪ENS神经元的神经化学表型，但目前仍缺乏关于其对速激肽能系统影响的数据。特别是，迄今为止尚未确定低剂量草甘膦暴露是否影响SP免疫反应阳性神经元群体或小肠中神经激肽受体的表达。本研究旨在评估口服低剂量草甘膦暴露对猪小肠中SP免疫反应阳性ENS神经元群体及NK1、NK2和NK3受体表达的影响。
二、研究设计与主要技术方法
本研究经奥尔什丁当地动物实验伦理委员会批准（批准号62/2020），所有程序符合欧盟2010/63/EU指令及波兰相关立法。研究对象为15头约8周龄、平均体重20 kg的雌性丹麦长白猪（幼母猪），选择雌性以维持均一的实验群体并减少与性别相关的生物学变异。动物在标准饲养条件下经7天适应期后，随机分为三组（每组n = 5）：对照组（C）每日接受一次空明胶胶囊；处理组G1接受相当于欧洲预估最大每日摄入量（0.05 mg/kg BW/天）的草甘膦（分析标准品，纯度>99.5%，Sigma-Aldrich）；处理组G2接受相当于可接受每日摄入量（0.5 mg/kg BW/天）的草甘膦，均以明胶胶囊形式在早晨喂食时口服给药，持续28天。饲料经认可的分析实验室检测，草甘膦残留低于定量限（LOQ；0.01 mg/kg）。动物每周称重并据此调整给药剂量。暴露结束后，以氮哌酮（Stresnil）预麻醉，随后静脉注射戊巴比妥钠实施安乐死，立即采集十二指肠、空肠和回肠样本。
研究采用三项主要技术方法：第一，双重免疫荧光染色，使用抗HuC/D蛋白抗体（小鼠，Invitrogen，稀释度1:1000）作为泛神经元标记物，使用抗SP抗体（大鼠，AbDSerotec，稀释度1:150）检测SP免疫反应性，以Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 546标记的二抗进行可视化。在每个肠段的每个神经丛中，每只动物至少分析500个HuC/D阳性神经元，SP阳性神经元百分比以所有HuC/D阳性神经元的比例计算；每组每种神经丛分析50个神经节（每只动物10个）以评估每神经节神经元数量。第二，RT-qPCR分析，从约50 mg全层肠壁组织（含浆膜、外肌层、黏膜下层和黏膜）中提取总RNA，逆转录合成cDNA后，以猪GAPDH为参考基因，检测TACR1（NK1）、TACR2（NK2）和TACR3（NK3）的表达水平，引物使用Primer-BLAST设计，相对表达量采用2?ΔCt法计算。第三，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性测定，组织匀浆后使用商品化SOD检测试剂盒（Cayman Chemical），基于黄嘌呤氧化酶产生的超氧自由基对四唑盐还原的抑制原理，在450 nm处测定吸光度，以Bradford法测定总蛋白含量并将SOD活性标准化为U/mg蛋白。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），当组间效应显著时采用Tukey HSD事后检验，以p < 0.05为差异显著标准。
三、研究结果
3.1 SP免疫反应阳性神经元双重免疫荧光分析
草甘膦暴露与所有被分析肠段和肠神经丛中SP免疫反应阳性神经元百分比的增加相关，但变化幅度和统计学显著性因剂量和肠段而异。在十二指肠中，SP免疫反应阳性（SP-IR）神经元的百分比随草甘膦剂量增加而升高。在肌间神经丛（MP）中，G2组数值最高（5.55 ± 0.47%），显著高于对照组（1.22 ± 0.15%；p < 0.001）和G1组（1.55 ± 0.24%；p < 0.001）。外黏膜下神经丛（OSP）和内黏膜下神经丛（ISP）中也观察到类似增加，G2组显著高于对照组和G1组。在空肠中，草甘膦暴露增加了所有三个肠神经丛中SP-IR神经元的百分比，G2组的增加幅度大于G1组，两组暴露组在MP、OSP和ISP中均有显著差异。最大相对增加出现在ISP，G2组SP-IR神经元百分比达到43.06 ± 1.21%，而对照组为12.35 ± 0.70%（p < 0.001）。在回肠中，草甘膦暴露后SP-IR神经元百分比同样增加。MP中G2组显著高于对照组（6.11 ± 0.53% vs. 1.01 ± 0.19%；p < 0.001），OSP和ISP中也观察到显著增加，尤其在G2组。总体而言，所有被分析肠段和肠神经丛均观察到剂量相关效应，G2组SP-IR神经元百分比显著高于G1组。相比之下，草甘膦暴露未显著影响任何被分析肠段或肠神经丛中每个神经节的HuC/D阳性神经元数量，各组间虽存在微小数值差异，但均未达到统计学显著水平，且无明显剂量依赖模式。
3.2 NK受体表达的RT-qPCR分析
草甘膦暴露导致速激肽受体基因表达发生受体特异性和肠段特异性变化。与对照组相比，TACR2和TACR3存在显著差异，而TACR1表达保持不变。TACR1（NK1）mRNA表达在任何被分析肠段中组间均无显著差异，两个草甘膦暴露组的转录水平与对照组相当，无明显剂量相关模式。TACR2（NK2）mRNA表达在十二指肠中两个草甘膦暴露组均较对照组显著升高（p < 0.001）；相反，在回肠中，G2组TACR2 mRNA表达较对照组显著降低（p < 0.05），而空肠中未见显著变化。G1和G2组之间在任何被分析肠段中均无显著差异。TACR3（NK3）mRNA表达在十二指肠中两个草甘膦暴露组均较对照组显著降低（p < 0.001）；在空肠中，G2组观察到显著降低（p < 0.05），而G1组的变化未达统计学显著；在回肠中，TACR3 mRNA表达呈下降趋势，但差异未达统计学显著。G1和G2组之间无显著差异。
3.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性
在十二指肠中，SOD活性为C组198.25 ± 2.15 U/mg蛋白、G1组201.65 ± 1.74 U/mg蛋白、G2组221.65 ± 0.97 U/mg蛋白。单因素方差分析显示处理效应显著（F(2,12) = 55.77，p < 0.001），Tukey事后检验显示G2组SOD活性显著高于C组和G1组（p < 0.001），而C组与G1组之间无显著差异。在空肠中，SOD活性为C组204.54 ± 1.05 U/mg蛋白、G1组207.12 ± 1.56 U/mg蛋白、G2组206.87 ± 1.97 U/mg蛋白，组间无统计学显著差异（F(2,12) = 0.82，p = 0.464）。在回肠中，SOD活性为C组176.76 ± 1.53 U/mg蛋白、G1组180.23 ± 0.89 U/mg蛋白、G2组195.32 ± 1.82 U/mg蛋白，单因素方差分析显示处理效应显著（F(2,12) = 45.36，p < 0.001），Tukey事后检验显示G2组SOD活性显著高于C组和G1组（p < 0.001），C组与G1组之间差异不显著。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究结果表明猪口服低剂量草甘膦可诱导小肠ENS中显著的神经化学变化，表现为SP免疫反应阳性神经元百分比的增加，并伴随肠壁中速激肽受体基因表达的改变。在所有被分析肠段中均观察到SP免疫反应阳性神经元百分比的增加，多数情况下呈明显剂量相关模式。同时观察到速激肽受体基因表达的受体特异性和区域特异性调控。这些结果与既往报道一致，即SP免疫反应阳性肠神经元的百分比可能响应损伤性、炎症性或毒性因素而增加，这被解释为ENS适应性神经化学重塑的一部分。
SP在ENS中具有重要功能，包括内脏疼痛传导、胃肠运动调节和炎症反应调控。SP免疫反应阳性神经元比例的增加可能反映SP表达增强和肠神经元神经化学表型的变化，表明ENS对草甘膦暴露的塑性响应。重要的是，SP免疫反应阳性神经元比例的增加并未伴随任何被分析肠段或肠神经丛中每神经节HuC/D阳性神经元总数的显著变化，这支持所观察到的SP免疫反应性增加更可能与肠神经元神经化学表型改变相关，而非总体神经元群体的减少。
速激肽受体基因表达分析提供了关于所观察变化性质的额外信息。值得注意的是，SP阳性神经元百分比的增加与组织水平速激肽受体mRNA表达的变化之间未观察到平行关系。尽管SP阳性神经元百分比显著增加，TACR1表达保持稳定，而TACR2和TACR3呈现受体特异性和区域特异性调控模式。这种表观分离应谨慎解释，因为两种分析在不同生物学组织层面进行：SP免疫反应性在肠神经元中特异性定量，而TACR mRNA表达在全层肠壁组织中评估，该组织包含多种神经元和非神经元细胞群体。因此，缺乏平行关系可能至少部分反映了细胞和解剖分辨率的差异。特别值得关注的是TACR2的区域依赖性调控，因为NK2受体在胃肠运动调节中发挥重要作用，包括肠平滑肌收缩。TACR2在十二指肠和回肠中调控方向相反，进一步支持草甘膦暴露后速激肽信号传导存在区域特异性调节的概念。十二指肠中观察到最一致的速激肽受体表达变化，一种可能的解释是口服草甘膦后近端小肠可能经历相对较高的局部暴露。
在炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）、DSS诱导的肠道炎症模型及感染性病因的炎症过程中，已证明SP和神经激肽受体表达增加与神经免疫轴激活相关。在丙烯酰胺和双酚A暴露模型中同样观察到类似变化，均被解释为ENS适应性可塑性的表现。本研究的重要新颖之处在于证明草甘膦暴露不仅与ENS中SP免疫反应性组分的增加相关，还与肠壁中神经激肽受体基因表达的选择性区域特异性调控相关。TACR2和TACR3表达的相反趋势表明对草甘膦暴露的响应是复杂的，不能仅以SP免疫反应性的增加来解释。
关于潜在分子机制，讨论提出了几种可能的中介途径。其一为氧化应激诱导，这在草甘膦暴露研究中已有充分记载。本研究中，较高草甘膦剂量组的十二指肠和回肠SOD活性显著升高，而空肠中无显著变化。SOD作为酶促抗氧化防御系统的主要组分，其活性升高可能反映对增强的氧化挑战的补偿性响应。其二为肠道菌群调节，草甘膦对细菌莽草酸途径的抑制可能扰乱肠道菌群组成，潜在促进促炎环境的形成，通过微生物群-肠-神经系统轴影响ENS。其三为免疫应答激活，草甘膦已被证明可影响促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-1β和IL-6）的产生，这些介质可影响肠神经元和胶质细胞，导致神经肽表达变化。
讨论部分同时承认了多项研究局限性：SOD活性仅作为抗氧化防御的指标，未纳入氧化损伤或氧化还原状态的其他标记物；未直接评估肠道菌群组成变化、免疫激活或肠运动和感觉的功能改变；未定量血浆或肠组织中的草甘膦及其主要代谢物AMPA；RT-qPCR分析在全层肠壁匀浆中进行，所观察到的TACR2和TACR3 mRNA表达变化不能特异性归因于肠神经元；受体表达仅在mRNA水平评估，未在蛋白水平确认；仅纳入雌性猪，考虑到ENS神经化学和外源物代谢中已报道的性别相关差异，研究结果不一定能外推至雄性。
研究结论部分指出：本研究证明猪口服低剂量草甘膦与小肠肠速激肽系统特定组分的显著改变相关。草甘膦暴露增加了十二指肠、空肠和回肠中SP免疫反应阳性肠神经元的百分比，并诱导了速激肽受体基因表达的区域特异性变化。TACR2 mRNA表达在两个草甘膦暴露组的十二指肠中升高，但在较高草甘膦剂量组的回肠中降低；TACR3 mRNA表达在两个暴露组的十二指肠和较高剂量组的空肠中降低；TACR1 mRNA表达保持不变。这些发现表明肠速激肽系统对草甘膦的响应是复杂的，不能仅以SP免疫反应性的变化来解释。所观察到的神经化学重塑可能代表ENS对低剂量外源物暴露的适应性响应，但其功能后果仍有待确定。需要整合神经化学、炎症、菌群相关及功能终点的进一步研究，以阐明这些变化的机制和生理意义。
