《International Journal of Molecular Sciences》：Temporal Neuroimmune Changes During Primary and Persistent Experimental Toxoplasmic Encephalitis
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弓形虫（Toxoplasma gondii）在中枢神经系统中持续存在，并可能引起严重的弓形虫脑炎（toxoplasmic encephalitis，TE），尤其是在免疫功能低下的宿主中。研究人员既往研究表明，弓形虫诱导的神经病理学涉及氧化应激与硝化应激、细胞凋
弓形虫（Toxoplasma gondii）在中枢神经系统中持续存在，并可能引起严重的弓形虫脑炎（toxoplasmic encephalitis，TE），尤其是在免疫功能低下的宿主中。研究人员既往研究表明，弓形虫诱导的神经病理学涉及氧化应激与硝化应激、细胞凋亡、胶质细胞活化、血脑屏障损伤以及GMF-β和SAP/NF-κB相关反应。本研究探讨了早期和慢性实验性感染期间CD68、S100B、Foxp3和IL-5的时序性免疫反应性。将24只雌性瑞士白化小鼠分为一个未感染对照组和三个ME49感染组，分别在感染后第10、30和60天进行检查（每组n = 6）。通过免疫组织化学和定量图像分析评估标志物的免疫反应性。CD68免疫反应性在第10天显著升高，第30天进一步上升，并在第60天维持高水平。相比之下，S100B、Foxp3和IL-5的免疫反应性在第10天有限，但在第30天和第60天显著增加。最值得注意的是，IL-5从第30天到第60天持续显著增加，而CD68、S100B和Foxp3在此期间维持相似的高水平。这些时序性差异模式表明，早期髓系/吞噬溶酶体反应先于已建立的星形胶质细胞、Foxp3相关调节性及细胞因子相关组织反应。IL-5的持续增加，连同持续的神经病理学变化，支持晚期慢性弓形虫脑炎是一个活跃而非静止的神经免疫病理阶段的解释。
一、研究背景与科学问题
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛分布的人兽共患原虫，约三分之一的人类群体曾暴露于该病原体。急性感染期，弓形虫以速殖子形式播散，可通过血脑屏障或感染白细胞进入中枢神经系统，引发神经炎症。急性期后部分速殖子分化为缓殖子并形成组织包囊，主要存在于神经元中，从而建立慢性感染。慢性感染的维持依赖于控制寄生虫与限制炎症组织损伤之间的平衡；免疫功能受损时，潜伏感染可能再激活并发展为弓形虫脑炎（toxoplasmic encephalitis，TE），尤其在晚期HIV感染患者、移植受者及接受免疫抑制治疗者中具有重要临床意义。
既往研究已表明弓形虫诱导的神经病理学涉及氧化与硝化应激、凋亡、胶质活化、血脑屏障损伤及GMF-β和SAP/NF-κB相关反应。然而，不同免疫标志物在感染早期至慢性期过程中的时序性变化尚未被系统评估。CD68作为单核吞噬细胞相关跨膜糖蛋白，主要定位于内体-溶酶体区室，其免疫反应性可反映髓系细胞及吞噬溶酶体活性；S100B为星形胶质细胞富集的钙结合蛋白，与反应性胶质增生和神经元损伤相关；Foxp3是调节性T细胞（Treg）分化的关键转录因子，在慢性感染中主要聚集于脑膜区室；IL-5为多效性细胞因子，在弓形虫感染中的作用因模型而异。本研究旨在同一实验模型和连续感染阶段中，同时评估CD68、S100B、Foxp3和IL-5的时序性变化，以阐明实验性弓形虫脑炎从早期髓系活化到慢性胶质和免疫调节改变的神经免疫病理重塑过程。
二、研究设计与主要技术方法
本研究使用24只成年雌性瑞士白化小鼠，分为未感染对照组和三个ME49弓形虫感染组（每组6只），分别在感染后第10、30和60天实施安乐死并采集脑组织。感染采用低毒力成囊型ME49株，通过腹腔注射含15–20个组织包囊的0.25 mL无菌生理盐水悬液建立模型。主要技术方法包括：脑组织压片法快速检测组织包囊；苏木精-伊红染色进行组织病理学评估；免疫过氧化物酶染色检测CD68、S100B、Foxp3和IL-5免疫反应性；计算机辅助图像分析系统定量免疫阳性面积百分比；统计学分析采用单因素方差分析和Tukey HSD检验，并以Kruskal-Wallis非参数检验进行敏感性验证。
三、研究结果
3.1 感染确认与一般观察
对照组未检出组织包囊。感染组在压片制备和/或组织学切片中均确认存在含缓殖子的圆形或椭圆形组织包囊。第10天包囊稀少且局灶分布；第30天包囊更易观察到，并伴有更显著的多灶性炎症和胶质反应；第60天包囊仍存在于脑实质中，伴随持续的胶质增生和炎症改变。整个实验期间未观察到严重急性弓形虫病的临床症状。
3.2 组织病理学发现
H&E染色显示多灶性炎症、胶质增生和神经退行性改变，伴有弓形虫组织包囊。第10天病理改变轻微且局灶，主要为血管充血、轻度血管周围单核细胞套袖、局灶性脑膜单核细胞浸润和早期胶质增生。第30天病变严重程度和实质分布增加，血管周围单核细胞套袖、非化脓性脑膜炎症、多灶性胶质增生和胶质结节形成更为显著，神经元变性和神经毡空泡化更常见。第60天持续存在血管周围和脑膜单核细胞炎症、多灶性乃至广泛胶质增生、胶质结节、神经毡空泡化和持续的神经元退行性及坏死性改变，符合已建立的晚期慢性弓形虫性脑膜脑炎特征。
3.3 CD68免疫反应性
CD68免疫反应性在感染后第10天即较对照组显著升高，第30天进一步增加并达到高水平，第60天维持该水平。定量分析显示对照组、第10天、第30天和第60天组免疫阳性面积百分比分别为1.864 ± 0.375%、6.020 ± 0.406%、8.337 ± 0.508%和8.063 ± 0.426%，组间差异显著（F(3,20) = 288.11，p < 0.001）。第30天与第60天之间无显著差异（p = 0.695）。值得注意的是，部分具有神经元形态的大细胞呈现颗粒状胞体CD68免疫反应性，且同一视野内阳性与阴性细胞并存，提示选择性细胞相关染色模式。该结果表明髓系/吞噬溶酶体活化是早期神经炎症期的主要特征，并在慢性期持续维持。
3.4 S100B免疫反应性
S100B免疫反应性在第10天较对照组略有增加但未达统计学显著（4.226 ± 0.496%对3.555 ± 0.452%，p = 0.082）。第30天在浅表-软膜下、血管周围区域及炎症灶周围显著增加（7.771 ± 0.506%），第60天维持高水平（8.077 ± 0.349%），组间差异显著（F(3,20) = 159.72，p < 0.001）。第30天与第60天无显著差异（p = 0.656）。S100B阳性胶质细胞体和纤维状突起围绕免疫阴性的弓形虫组织包囊形成独特的囊周胶质反应，并在致密炎症灶边缘呈现显著增强的病灶周围胶质模式。该结果表明星形胶质细胞反应在慢性期建立并持续存在，晚于CD68介导的早期髓系活化。
3.5 Foxp3免疫反应性
Foxp3免疫反应性在第10天有限，与对照组无显著差异（1.292 ± 0.204%对0.895 ± 0.339%，p = 0.176）。第30天显著增加（4.794 ± 0.455%），第60天维持高水平（5.053 ± 0.227%），组间差异显著（F(3,20) = 285.40，p < 0.001）。第30天与第60天无显著差异（p = 0.517）。Foxp3阳性小单核细胞主要集中于血管周围、脑膜和脑室炎症区域，提示调节性细胞成分在血管和脑膜区室中组织化，而非弥漫性实质聚集。该结果表明Foxp3相关调节性细胞反应随慢性化而增强，并在慢性期形成高水平平台。
3.6 IL-5免疫反应性
IL-5免疫反应性在第10天弱且局灶，与对照组无显著差异（1.632 ± 0.143%对1.223 ± 0.443%，p = 0.241）。第30天显著增加（4.112 ± 0.375%），第60天进一步显著增加（4.848 ± 0.412%），较第30天增加17.9%（p = 0.0109），组间差异显著（F(3,20) = 146.53，p < 0.001）。IL-5反应分布于室管膜-脑室周围区域、神经实质、海马细胞层、具有神经元形态的大细胞及小胶质细胞中。与CD68、S100B和Foxp3在慢性期达到高而相对稳定水平不同，IL-5从第30天到第60天持续显著增加，是本研究最突出的时序性发现。
四、讨论与结论
本研究显示实验性弓形虫脑炎是一个阶段特异性的神经免疫病理过程。CD68是唯一在第10天即显著升高的标志物，表明髓系/吞噬溶酶体活化是早期神经炎症期的主要特征。S100B、Foxp3和IL-5反应在第30天出现，伴随多灶性胶质增生、血管周围-脑膜炎症和神经元损伤，表明胶质和免疫调节成分在慢性感染进展中显著参与。第60天时，CD68、S100B和Foxp3维持第30天的高水平，而IL-5持续显著增加，构成最突出的时序性发现。该分化性反应模式表明晚期慢性弓形虫脑炎并非静止的终末阶段，而是在已建立的髓系、胶质和调节性反应背景下，细胞因子微环境持续重塑的动态神经免疫病理时期。
研究局限性包括：仅使用雌性小鼠，未将性别作为变量；仅使用ME49株和腹腔接种途径；采用单标志物免疫过氧化物酶染色，未进行细胞类型特异性双重/多重免疫荧光标记；研究为描述性和观察性，未采用中和、阻断或基因缺陷方法；未定量组织包囊负荷或与免疫反应性进行相关性分析；未设置免疫抑制组，因此结果不应直接外推至免疫抑制下的再激活相关弓形虫脑炎。
研究结论：实验性弓形虫脑炎是从早期炎症改变进展至持续性慢性神经炎症的阶段特异性神经免疫病理过程。CD68和S100B发现表明早期髓系/吞噬活化之后是慢性期显著的星形胶质细胞反应性和胶质增生性实质重塑。Foxp3和IL-5发现表明血管周围-脑膜调节性细胞组织和阶段依赖性细胞因子反应随慢性化而发展。最突出的发现是IL-5免疫反应性在晚期慢性期持续增加，而CD68、S100B和Foxp3相关反应在慢性期达到高而稳定的水平。这种时序性差异表明晚期慢性弓形虫脑炎不是固定的终末阶段，而是在已建立的髓系、星形胶质细胞和调节性细胞反应背景下细胞因子微环境持续重塑的动态免疫病理过程。这些发现提示慢性感染期间神经免疫活性可能持续存在，并强调需要在临床相关的免疫抑制和寄生虫再激活模型中进一步研究，以确定免疫受损宿主再激活期间是否也出现类似的时序模式。
