基于PacBio 16S rRNA测序的畜禽泥浆、肉鸡废弃物及厌氧消化污泥施用后土壤微生物群高分辨率分类评估

《Environments》：High-Resolution Taxonomic Assessment Using PacBio 16S rRNA Sequencing of Farm Animal Slurry, Broiler Waste and Anaerobically Digested Wastewater Treatment Sludge and Description of Soil Microbiota

　　

有机废弃物作为肥料施用对可持续农业至关重要，前提是由此产生的微生物群落变化不会破坏养分循环或土壤肥力。据研究人员所知，本研究首次采用PacBio 16^S rRNA测序技术表征废弃物施用于土地后土壤微生物群的变化。该技术提供高分辨率的分类学信息，可改进对复杂土壤微生物群落的表征。为评估五种有机废弃物的微生物群并描述田间施用后的土壤微生物群，18个地块每种废弃物设3个重复，以氮等效速率模拟条带施用。在施用后0、1、3、6和10周采集土壤芯样。施用前土壤中的主要属为Niallia（7.6%）和Unclassified_type_III（7.3%）。废弃物施用后，优势属包括：牛处理土壤中UCG-001（13.3%）和DMER64（8.8%）；羊处理土壤中Candidatus_Udaeobacter（8.5%）和unclassified_Xanthobacteraceae（7.9%）；猪处理土壤中Niallia（6.1%）和Candidatus_Udaeobacter（5.8%）；家禽处理土壤中Staphylococcus（27.3%）和Brachybacterium（26.7%）；以及厌氧消化污水处理污泥（anaerobically digested wastewater treatment sludge, DWWTS）处理土壤中unclassified_Anaerolineaceae（25.8%）和Thiopseudomonas（14.2%）。土壤恢复至施用前微生物群所需时间范围为0至6周。有机废弃物类型强烈影响扰动的幅度和持续时间，长期的群落偏移可能影响微生物多样性、养分循环和土壤肥力。

本研究针对有机废弃物作为肥料施用对土壤微生物群落的影响展开。土壤微生物群在维持土壤肥力、有机质转化、养分循环及生物修复中发挥关键作用。以往研究多采用短读长测序技术（如Illumina、Ion Torrent），仅覆盖16^S rRNA基因高变区，可能导致基因组区域低估或分类学分配模糊，且不同研究关于粪肥施用对土壤微生物群的影响尚无一致结论。PacBio循环共有测序（circular consensus sequencing, CCS）作为第三代测序技术，可对全长16^S rRNA基因进行测序，分类准确性超过99.9%，更适合解析复杂土壤微生物组。研究人员首次采用PacBio 16^S rRNA测序表征牛、羊、猪浆料，肉鸡废弃物及厌氧消化污水处理污泥（DWWTS）的微生物群，并描述田间施用后10周内土壤微生物群的时间变化，以期明确不同废弃物对土壤微生物扰动程度及恢复周期，为可持续农业中的有机废弃物管理提供科学依据。

研究在爱尔兰韦克斯福德Johnstown Castle开展，设置18个1 m²地块，每种废弃物3个重复，以氮等效速率模拟条带施用。牛、猪、羊浆料分别来自米斯郡、科克郡和卡文郡商业农场浆坑；家禽废弃物取自卡文郡肉鸡舍；生物固体来自废水处理厂厌氧消化及巴氏杀菌后产物。土壤芯样在施用后0、1、3、6和10周采集，提取DNA后，利用PacBio Revio平台进行全长16^S rRNA扩增子测序（引物27F/1492R），经DADA2和QIIME2处理，基于Silva数据库注释扩增序列变体（amplicon sequence variants, ASVs），计算Shannon指数（Shannon index, SI）和Berger–Parker指数（Berger–Parker index, BP），并采用主坐标分析（principal coordinates analysis, PCoA）和非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling, NMDS）评估Beta多样性。

**3.1 可变天气条件**
研究期间降雨量平均3.5 mm，气温5.8–23.3 °C，土壤温度11.8–21.0 °C。天气条件变化可能影响废弃物分解和微生物群落动态。

**3.2 有机废弃物初始ASV丰富度较高，施入土地后显著下降**
共40个样本测序，平均每个样本获得1034个ASVs。废弃物ASVs平均2445±952，显著高于土壤对照（668±158）。施用后平均ASVs从立即时的2445降至10周后的746，反映废弃物引入的微生物丰富度在土壤中快速下降。

**3.3 门水平动态显示废弃物驱动的暂时性转变，并逐步回归土壤微生物群**
土壤对照以Pseudomonadota（22.3%）、Planctomycetota（21.8%）和Bacillota（19.2%）为优势门。牛浆以Bacteroidota（33.9%）为主，施用后土壤Bacteroidota先升高，随后被Planctomycetota和Pseudomonadota等取代，10周时恢复至近土壤水平。羊浆中Campylobacterota（35.2%）优势，但施用后土壤原有门级群落迅速主导。猪浆中Bacteroidota（44.2%）优势，施后短时升高后，Planctomycetota、Bacillota和Pseudomonadota随时间恢复主导地位。家禽废弃物以Actinomycetota（73.9%）和Bacillota（24.2%）为主，前3周仍占优势，6周后下降，10周时Pseudomonadota（33.0%）和Planctomycetota（22.1%）重新主导。DWWTS以Chloroflexota（27.6%）、Bacteroidota（20.0%）等为主，施用后土壤中Chloroflexota等短暂升高，3周后转向土壤型群落。

**3.4 属水平群落以低丰度类群为主，废弃物驱动的变化具有暂时性且恢复至土壤特征**
土壤优势属包括Niallia（7.6%）、unclassified_type_III（7.3%）、unclassified_Xanthobacteraceae（6.0%）等。牛浆施用后仅立即出现UCG-001（13.3%）和DMER64（8.8%），随后土壤固有属（Flavobacterium、Niallia等）恢复。羊浆处理整个实验期土壤固有属（Candidatus_Udaeobacter、unclassified_Xanthobacteraceae）保持优势。猪浆处理在3周时出现Dysgonomonas（27.6%）短暂高峰，但可能为点源污染，此外土壤属逐步恢复。家禽废弃物处理在0–3周以Staphylococcus（27.3%）、Brachybacterium（26.7%）、Corynebacterium（20.6%）为优势，且检测到Brachybacterium paraconglomeratum（15.5%）、Corynebacterium stationis（13.0%）和Staphylococcus arlettae（5.2%）三个物种，持续至6周。DWWTS处理在1周内仍以unclassified_Anaerolineaceae（36.4%）为优势，但3周后unclassified_type_III、unclassified_Xanthobacteraceae和Niallia取代主导。

**3.5 Alpha多样性显示废弃物群落多样性较低、优势度较高，施入土壤后逐渐恢复**
BP指数在DWWTS最高（0.16）、家禽其次（0.13），施用后随时间下降。SI指数土壤对照为5.27–5.81；羊浆施用无显著影响（5.41–5.68）；猪浆在3周出现降低（5.14）与Dysgonomonas高丰度有关；家禽使SI降至5以下持续至6周；DWWTS处理SI在3周后恢复至5.4。

**3.6 Beta多样性显示废弃物和土壤群落分离，随时间趋向土壤群落**
基于Bray–Curtis距离的PCoA和NMDS显示，废弃物本身及施用初期样品与土壤对照明显分离，而后期样品与土壤对照聚类。基于unweighted UniFrac的NMDS显示废弃物独有谱系在土壤中消失，weighted UniFrac则显示高丰度优势谱系的差异，后期均趋向土壤群落结构。

讨论指出，有机废弃物类型显著影响土壤微生物群落扰动的幅度和持续时间。牛、猪浆料影响短暂（约1周），羊浆几乎无影响，而家禽废弃物和DWWTS影响更持久（分别约10周和3周）。这种差异可能归因于废弃物理化性质，如pH和干物质含量：家禽废弃物pH 7.9、干物质71.4%，DWWTS pH 8.2，可能改变土壤pH和水分，选择耐逆类群，延缓恢复。此外，羊浆中检出Arcobacter，家禽废弃物中检出B. paraconglomeratum、C. stationis和S. arlettae，提示病原菌传播的“一体化健康”风险。

研究结论：本研究首次采用PacBio 16^S rRNA测序表征有机废弃物施用后土壤细菌微生物群。结果表明，有机废弃物类型强烈影响土壤微生物群变化，羊浆相关类群在施用后立即未检出，牛和猪浆相关类群在1周内不再检出，而DWWTS和家禽废弃物分别需3周和10周才恢复至施用前轮廓。长期群落偏移可能降低微生物多样性，有利于病原菌或耐逆类群，进而削弱养分循环和土壤肥力。