《Viruses》：A Human iPSC-Derived Tri-Culture Model of NeuroHIV: HIV Infection, Antiretroviral Drug Effects, Microglial Morphology, and Neuronal Calcium Dynamics
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摘要专业翻译
HIV相关神经认知障碍（HAND）即使在有效抗逆转录病毒治疗（ART）下仍可持续存在，并与小胶质细胞中持续存在的中枢神经系统（CNS）病毒储存库、慢性神经炎症、突触功能障碍及神经元损伤相关。因此，需要人类相关的多细胞CNS模型来阐明神经HIV发病
摘要专业翻译
HIV相关神经认知障碍（HAND）即使在有效抗逆转录病毒治疗（ART）下仍可持续存在，并与小胶质细胞中持续存在的中枢神经系统（CNS）病毒储存库、慢性神经炎症、突触功能障碍及神经元损伤相关。因此，需要人类相关的多细胞CNS模型来阐明神经HIV发病机制及ART神经毒性。研究人员建立并表征了一个完全由人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的同基因CNS三细胞共培养模型，包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，该模型在体外可维持活力及功能活性长达32天。利用小胶质细胞嗜性的荧光HIV报告病毒GFP-HIV-AD8，研究人员证明了IBA1?小胶质细胞的感染，而未检测到IBA1?细胞或TUBB3?神经元的感染。HIV复制在感染后14天内被定量检测，并被第一代整合酶链转移抑制剂（INSTI）方案艾维雷韦/替诺福韦酯/恩曲他滨（EVG/TDF/FTC）以及第二代INSTI方案多替拉韦/替诺福韦酯/恩曲他滨（DTG/TDF/FTC）和比克替拉韦/替诺福韦艾拉酚胺/恩曲他滨（BIC/TAF/FTC）有效抑制，药物浓度基于已报道的血浆Cmax值。HIV感染使小胶质细胞活力降低约70%，较低体外ART浓度可部分挽救该效应，但含DTG方案在超治疗剂量3× Cmax条件下使损伤加重。在未感染培养物中，DTG诱导了小胶质细胞形态学改变，与反应性或功能障碍状态一致。钙成像揭示了ART特异性神经元效应：EVG/TDF/FTC降低神经元活性，而BIC/TAF/FTC增强神经元活性。在HIV感染培养物中，DTG在病毒抑制条件下缩短了神经元锋电位时程，鉴定出一种HIV–DTG相关的电生理表型。总体而言，BIC/TAF/FTC在本供体细胞系所评估的细胞学和电生理终点中展现出最优谱系。综上，这些发现建立了一个hiPSC来源的CNS三细胞共培养模型，可用于神经HIV病毒学、ART效应及神经元功能的受控研究。
论文解读
一、研究背景与意义
HIV相关神经认知障碍（HAND）即使在有效抗逆转录病毒治疗（ART）下仍影响30%–50%的HIV感染者，且在老龄化HIV人群中患病率持续上升。HAND的发病机制涉及多因素，包括HIV蛋白表达、中枢神经系统（CNS）病毒储存库持续存在、慢性免疫激活、神经炎症以及ART相关神经毒性。小胶质细胞作为CNS常驻髓系细胞，是HIV在大脑中的既定细胞储存库，即使在抑制性ART条件下仍可潜伏或低水平复制病毒。感染的小胶质细胞分泌神经毒性因子，包括炎性细胞因子、趋化因子及gp120和Tat等病毒蛋白，间接破坏神经元功能与存活。神经元不被直接感染，这一特征在本模型中得到重现。
现有研究模型存在明显局限：人源化小鼠模型和HIV-1转基因啮齿动物及SIV感染的猕猴模型成本高昂、通量低，且常无法完全重现人类特异的病毒-宿主相互作用、神经免疫信号或ART药代动力学；永生化细胞系缺乏原代细胞特性，无法支持神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞间维持CNS稳态所必需的复杂交互；原代人胎儿或成人CNS细胞来源稀缺、变异性大且获取存在伦理挑战。因此，迫切需要包含多种疾病相关细胞类型、能够重现HIV感染动力学并支持神经HIV病毒学、ART疗效测试及神经毒性评估的人iPSC（hiPSC）来源CNS模型。现有大多数平台为单培养或简单的双共培养，缺乏包含HIV在大脑中主要靶细胞——小胶质细胞在内的完整三细胞架构。
二、研究内容与结论概述
研究人员建立了包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的hiPSC来源三细胞共培养模型，该模型适用于高内涵成像和动态单细胞钙成像等功能性读出，并测试了HIV感染及含整合酶链转移抑制剂（INSTI）的ART联合方案的效果。研究证明该模型在体外第32天（DIV32）仍保持健康状态，并证实：（1）该模型支持IBA1?小胶质细胞中的生产性HIV感染；（2）HIV复制可通过GFP表达进行纵向定量；（3）三种主要ART联合方案有效抑制HIV复制；（4）HIV感染降低小胶质细胞活力，较低体外ART浓度可部分挽救，但3× Cmax DTG/TDF/FTC条件加重损伤；（5）DTG及DTG/TDF/FTC在3× Cmax下诱导小胶质细胞形态学改变，与活化或毒性一致；（6）ART联合方案对神经元钙动力学表现出差异性效应，第二代INSTI方案尤其是BIC/TAF/FTC展现出有利谱系；（7）HIV感染在DTG存在下缩短神经元锋电位时程，这是对HAND突触功能障碍具有意义的新发现。
三、关键技术方法
研究人员从BrainXell（美国威斯康星州麦迪逊）商业采购同基因hiPSC来源的皮层谷氨酸能神经元、皮层星形胶质细胞和小胶质细胞，以特定比例接种于96孔或384孔板构建三细胞共培养模型。使用基于pNL-AD8分子克隆（CCR5嗜性）改造的GFP表达HIV-1报告病毒株GFP-HIV-AD8（Virongy Biosciences定制），以1:250稀释度感染培养物。ART药物（DTG、EVG、BIC、TDF、TAF、FTC）基于临床血浆Cmax值设置0.1×、1×、3× Cmax及10 μM固定浓度梯度。采用Vala Sciences IC200动力学图像细胞仪（KIC?）进行活细胞GFP纵向成像、免疫荧光高内涵成像及Cal-520 AM/Cal-590 AM钙成像，使用CyteSeer?自动化图像分析软件进行细胞鉴定、形态学参数计算及钙瞬变分析。
四、研究结果
3.1 hiPSC三细胞共培养模型支持长期CNS细胞存活并维持细胞类型特异性标志物表达。 通过免疫荧光染色证实DIV32时TUBB3?神经元、GFAP?星形胶质细胞和IBA1?小胶质细胞清晰且空间有序地表达，小胶质细胞呈分枝状静息形态，总细胞密度稳定，无自发活化或反应性胶质增生迹象。
3.2 可检测的HIV报告基因表达定位于三细胞共培养中的小胶质细胞。 感染后第17天（DPI 17）固定染色显示，所有可检测的GFP?细胞均为IBA1?，未在TUBB3?神经元中检测到GFP信号，直接排除神经元感染。
3.3 利用GFP表达纵向定量三细胞共培养中的HIV复制。 活细胞GFP成像显示DPI 1仅见零星GFP?小胶质细胞，DPI 7显著增加并出现局部感染簇，DPI 14广泛分布。定量时间过程分析显示潜伏期（DPI 1–3）、缓慢上升期（DPI 3–9）和指数增长期（DPI 9–14）三个阶段，从DPI 7起感染组与未感染对照差异显著。
3.4 临床相关ART联合方案在三细胞共培养中抑制HIV复制。 DTG/TDF/FTC、EVG/TDF/FTC和BIC/TAF/FTC三种方案在0.1×、1×和3× Cmax浓度下均几乎完全抑制HIV复制，GFP?细胞数在整个时间过程中维持在基线水平。BIC/TAF/FTC方案病毒抑制速度略快于DTG或EVG方案。
3.5 HIV感染降低小胶质细胞活力；ART效应呈浓度依赖性。 HIV感染使小胶质细胞数量显著减少约70%。0.1× Cmax的DTG/TDF/FTC和EVG/TDF/FTC可部分挽救小胶质细胞数量，但3× Cmax DTG/TDF/FTC使小胶质细胞数量进一步降至HIV单独感染水平以下。HIV及ART均未显著改变神经元和星形胶质细胞总数。
3.6 ART改变未感染三细胞共培养中的小胶质细胞形态。 3× Cmax DTG单独处理显著减少活小胶质细胞数量并诱导形态改变，细胞变圆、突起减少、胞体宽度增加。DTG/TDF/FTC联合方案在1×和3× Cmax下效应更显著。EVG或BIC方案在任何浓度下均未观察到显著形态学改变。
3.7 HIV感染主导小胶质细胞形态学改变并超越ART效应。 无论ART治疗条件如何，GFP?感染小胶质细胞较GFP?旁观者小胶质细胞显著更细长且更不圆。即使在完全病毒抑制（1× Cmax ART）的培养物中，HIV诱导的形态学改变仍持续存在。
3.8 ART联合方案对神经元钙活性产生差异性影响。 EVG/TDF/FTC在3× Cmax下显著降低活性神经元比例、事件频率、放电比例、平均锋电位幅度和最大上升速度。DTG/TDF/FTC在3× Cmax下也降低活性神经元比例和事件频率。BIC/TAF/FTC在0.1× Cmax和10 μM下增加事件频率和放电比例，在10 μM下增加平均锋电位幅度，且在任何剂量下均未降低钙活性。
3.9 HIV感染联合DTG缩短神经元锋电位时程。 在HIV感染培养物中，DPI 1开始DTG治疗完全抑制病毒复制，但神经元锋电位时程较未感染DTG处理培养物显著缩短，而锋电位频率、幅度和上升速度无差异。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究的核心新颖性在于将商业来源的同基因神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞组分与纵向、细胞分辨的病毒学、形态学、药理学及功能性读出相整合。选择性小胶质细胞感染与HIV在CNS中对CD4?髓系细胞的已知限制性嗜性一致，但研究未进行GFAP共染色，不能正式排除星形胶质细胞低水平感染。三种ART方案均有效抑制病毒复制，但含DTG方案在超治疗剂量下表现出浓度依赖性小胶质细胞不良效应，这属于危害识别和安全边际暴露条件，不应解释为标准治疗剂量。DTG诱导的小胶质细胞形态改变与活化表型一致，可能伴随促炎细胞因子释放增加。EVG广泛降低神经元钙活性参数，而BIC/TAF/FTC增加多项钙活性参数。HIV感染与DTG联合缩短神经元锋电位时程是模型揭示的新生物学发现，锋电位时程是突触前钙内流和神经递质释放的重要决定因素，缩短的锋电位可能减少突触前钙内流并减弱神经递质释放，潜在损害网络同步性和信息处理。该效应发生在完全病毒抑制条件下，与抑制性ART期间神经炎症和CNS病理持续存在的证据一致。
研究结论：hiPSC来源的三细胞共培养是用于受控神经HIV研究的实验模型，能够同时评估HIV复制、ART疗效、小胶质细胞健康状态和神经元功能。研究数据揭示了不同ART联合方案在本供体系中所评估终点上的差异。该模型支持生产性HIV感染、ART效应及神经元-胶质细胞相互作用的受控研究。更广泛地用作比较药物筛选和机制假说生成的可操作基础，仍需在更多供体和病毒株中验证。
