检测无反应性觉醒综合征患者睡眠时的脑电觉醒指数

《iScience》：Detecting EEG index of arousal in sleeping patients with unresponsive wakefulness syndrome

　　

亮点
•UWS患者的睡眠-觉醒周期揭示了与觉醒相关的脑电动力学特征
•谱斜率反映了跨睡眠阶段的觉醒动力学
•谱熵和Lempel-Ziv复杂度与意识状态相关

摘要
意识被认为由两个组成部分定义：知觉和觉醒。然而，与知觉相比，用于表征觉醒的脑电图指标较少。由于临床上诊断为无应答觉醒综合征（UWS）的患者保留了睡眠-觉醒周期，但在意识方面表现出明显减少的可重复行为证据，他们的睡眠-觉醒模式可能为研究觉醒相关的脑电波动提供了一个有用的模型。本研究记录了对UWS患者、轻症意识状态患者和健康对照者的夜间多导睡眠图。脑电信号显示，谱斜率能够表征觉醒，并在所有三个组别中随睡眠阶段而变化。谱熵和Lempel-Ziv复杂度均能表征知觉，显示出意识状态与无意识状态之间的显著差异。这些发现为意识的双成分假设提供了基本证据。

图示摘要
引言
关于意识的辩论引起了全世界的关注。在一种流行的理论中，意识通常被描述为两个维度：知觉和觉醒。在这里，知觉指的是主观体验的存在和内容，包括感知、整合和响应内部或外部信息的能力。觉醒指的是清醒或警觉的水平，为知觉提供了基本的启用条件。大多数意识状态都可以通过这两个组成部分来描述（图1A）。与具有高度觉醒和知觉的健康清醒者不同，全身麻醉、非快速眼动睡眠第3期（N3）和昏迷状态具有低觉醒和低知觉。快速眼动睡眠（REM睡眠）具有相对较高的知觉但低觉醒，因为梦境通常发生在REM睡眠中并反映了丰富的主观体验。无应答觉醒综合征（UWS，也称为植物状态）患者在临床上表现为保留了觉醒，由睡眠-觉醒周期和脑干介导的功能反映，但在标准临床评估中显示出不可重复的行为证据意识证据。尽管大多数关于意识（尤其是意识障碍 [DOC]）的研究遵循这种意识的双成分假设，但与关于知觉脑电指标的众多研究相比，对觉醒的脑电指标知之甚少。

图1 研究设计概览
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(A) 理论与假设。左侧显示的二维意识框架改编自Laureys等人。(B) 特征提取与比较分析：详细说明脑电特征计算以及不同组别和睡眠阶段之间的比较分析。(C) 独立数据集验证：基于觉醒和知觉相关特征的睡眠分期和意识状态诊断。

与知觉的脑电指标不同，后者可以通过比较健康对照组（HCs）和UWS患者的清醒状态来检测，因为他们两者都具有高觉醒，而觉醒的脑电指标则更难研究。因为在大多数意识状态中，觉醒随着知觉一起波动（图1A）。例如，在健康人的睡眠-觉醒周期中，从清醒到N3睡眠，觉醒和知觉都持续下降。虽然REM睡眠通常通过与N3睡眠比较来研究知觉的生物标志物，但一些先前的研究表明REM睡眠的觉醒也比N3睡眠高，（图1A）。因此，觉醒和知觉的共同变化为区分觉醒和知觉的独立脑电指标造成了巨大障碍，甚至破坏了意识双成分假设的基础（意识中可能根本不存在独立的觉醒或知觉）。面对这一困境，临床上诊断的UWS患者的睡眠-觉醒周期为减少觉醒和知觉之间的混淆提供了一个有用的模型，因为这些患者表现出保留的睡眠-觉醒周期和脑干介导的觉醒，但在标准临床评估中缺乏可重复的行为证据意识证据。因此，UWS睡眠阶段之间的脑电波动可能更突出地反映觉醒相关的变化，而不是知觉相关的变化。最重要的是，这个解决方案现在是可行的。因为最近的研究已经证明，多导睡眠图（PSG）可以成功区分UWS的睡眠阶段，并且可以同时获取脑电图（EEG）信号，这已经被广泛用于意识神经底物的研究中。

在脑电信号上哪些测量可以作为觉醒的脑电指标候选？大多数以前关于意识的脑电研究专注于知觉的脑电指标。他们发现，反映神经动力学丰富性和多样性的脑电信号的谱熵和Lempel-Ziv复杂度可以被视为知觉的标志物。干扰复杂度指数，结合了经颅磁刺激与脑电图（TMS-EEG）和Lempel-Ziv复杂度，已被用于区分具有微弱且不稳定的意识的轻症意识状态患者。此外，alpha功率也是常见提到的与意识水平相关的脑电测量，在一些先前的研究中在UWS中显示出显著降低。与脑电复杂度的测量不同，另一种备受关注的是脑电功率谱的谱斜率。它代表了皮层活动的无标度成分，并可以根据睡眠和麻醉状态的结果反映意识水平。如前所述，睡眠和麻醉都表现出知觉和觉醒的降低；这些发现可能表明谱斜率也有可能反映觉醒水平。根据先前研究中的这些脑电测量，我们假设通过采用健康参与者和UWS参与者的睡眠-觉醒周期，应该能够实现揭示觉醒的不同脑电指标。

为实现上述目标，当前研究总共包括67名UWS患者、55名MCS患者和55名健康对照者。详见表1。整个研究包括两部分（图1）。在第一部分中，使用PSG记录夜间脑电波以及其他生理信号，包括眼电图（EOG）和肌电图（EMG），在16名UWS患者、18名MCS患者和18名健康对照者中进行。在清醒、N3睡眠和REM睡眠阶段内的脑电信号被用于计算每个组别的谱斜率、谱熵和Lempel-Ziv复杂度（图1B）。其次，使用健康参与者（n=37）的独立睡眠脑电数据集和两个独立的脑机接口（BCI）任务相关脑电数据集（第一个包括45名UWS患者和33名MCS患者，第二个包括6名UWS患者和4名MCS患者）对第一部分的发现进行了进一步验证（图1C）。根据意识的双成分假设，UWS患者在清醒阶段和REM睡眠期间均具有低于健康对照者和MCS患者的知觉，但在清醒、REM睡眠和N3睡眠之间的觉醒类似于健康对照者和MCS患者（图1A）。我们的结果表明，谱斜率可以作为觉醒的脑电指标，与分别作为知觉指标的谱熵和Lempel-Ziv复杂度不同。这些发现支持了意识的双成分理论，并为意识的生物底物提供了启示。

数据集 | 状态 | 受试者 | 性别（男/女） | 年龄（均值 ± 标准差） | ABI (%) | TBI (%) | CVD (%)
睡眠数据集1 | UWS | 16 | 9/7 | 51.68 ± 11.05 | 31.25% | 37.50% | 31.25%
睡眠数据集1 | MCS | 18 | 15/3 | 51.27 ± 9.63 | 5.55% | 44.44% | 50.00%
睡眠数据集1 | HC | 18 | 8/10 | 41.0 ± 9.99 | — | — | —
睡眠数据集2 | HC | 37 | 20/17 | 26.45 ± 8.11 | — | — | —
BCI任务数据集1 | UWS | 45 | 31/14 | 39.06 ± 14.17 | 26.66% | 42.22% | 31.11%
BCI任务数据集1 | MCS | 33 | 20/13 | 36.42 ± 14.48 | 15.15% | 66.67% | 18.18%
BCI任务数据集2 | UWS | 6 | 4/2 | 49.17 ± 8.45 | 50.00% | 50.00% | 0.00%
BCI任务数据集2 | MCS | 4 | 3/1 | 51.75 ± 19.35 | 75.00% | 25.00% | 0.00%

表1 数据集信息
数据集指定了本研究中使用的数据采集，包括两个睡眠数据集和两个BCI任务数据集。状态代表参与者的临床状态（UWS、MCS或HC）。性别以男/女报告，年龄以均值±标准差报告。ABI、TBI和CVD分别表示诊断为缺氧性脑损伤、创伤性脑损伤和脑血管/炎症性疾病的参与者百分比。“–”表示数据不可用。每个数据集的人口统计学信息提供在补充信息中。
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结果
UWS患者的睡眠模式改变
UWS患者的睡眠模式似乎以睡眠和觉醒之间的频繁变化为特征。为了评估组间差异，量化了几项睡眠结构指标，包括总睡眠时间（TST）、睡眠开始后清醒时间（WASO）、睡眠效率（SE）、睡眠维持效率（SME）、夜间清醒优势（NWD）和睡眠结构完整性（SAC）。图2显示了健康对照组、MCS组和UWS组的专家评分睡眠图。

图2 睡眠模式
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(A) 示例性睡眠图：上图代表健康对照组（HCs），中图描绘了轻症意识状态（MCS），下图显示了无应答觉醒综合征（UWS）。
(B) 每个组的总睡眠时间（TST），定义为睡眠期间时间（SPT；从第一个到最后一个睡眠阶段的间隔）内N1、N2、N3和REM睡眠阶段的累积时长。
(C) 每个组的睡眠开始后清醒时间（WASO），代表SPT内的总清醒时长。
(D) 睡眠效率（SE），计算为TST/卧床时间（TIB）× 100 (%)，其中TIB反映总记录时长。
(E) 睡眠维持效率（SME），计算为TST/SPT × 100 (%)。
(F) 睡眠结构完整性（SAC）：每个组中在记录的睡眠期间表现出所有标准睡眠阶段（N1、N2、N3和REM）的参与者百分比。
(G) 夜间清醒优势（NWD）：夜间清醒时长超过睡眠时长的参与者百分比。

白点表示均值，方框边界表示上下四分位数。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001。详细的统计信息见补充信息表S1。

为了分别比较健康对照组、MCS组和UWS组之间的这些标准睡眠指标，进行了单因素协方差分析（ANCOVAs），并以年龄作为协变量以控制潜在的年龄相关效应。使用Bonferroni校正进行了事后成对比较以评估组间差异。所有睡眠指标在组间均显示出显著差异（TST：F(2, 47) = 13.971，p < 0.001，ηp2 = 0.373；WASO：F(2, 48) = 14.401，p < 0.001，ηp2 = 0.375；SE：F(2, 47) = 13.728，p < 0.001，ηp2 = 0.369；SME：F(2, 48) = 17.104，p < 0.001，ηp2 = 0.416）。与健康对照组相比，健康对照组的TST显著高于MCS组（p = 0.03）和UWS组（p < 0.001）。MCS组也显示出高于UWS组的值（p = 0.016）。对于WASO，UWS和MCS患者表现出比健康对照组更频繁的睡眠-觉醒转换（UWS vs. HC：p < 0.001；MCS vs. HC：p = 0.003）。对于SE，健康对照组的值高于MCS组（p = 0.022）和UWS组（p < 0.001），而MCS组的值也高于UWS组（p = 0.025）。同样，对于SME，与健康对照组相比，健康对照组的值显著高于MCS组（p = 0.01）和UWS组（p < 0.001），而MCS组的值也高于UWS组（p = 0.01）（图2B–2E）。见表S1以获取详细的统计信息。三个组别之间的SAC和NWD存在显著差异，UWS组表现出最低的SAC和最显著的NWD。如图2F和2G所示，只有62.5%的UWS患者表现出所有标准睡眠阶段的存在。此外，健康对照组中没有NWD，但在22.2%的MCS患者和50%的UWS患者中存在NWD。这些结果突出了每个组别独特的睡眠结构，其特征是UWS患者的SE和维持受损，与健康对照组和MCS组观察到的更稳定的睡眠模式形成对比。

作为觉醒脑电指标的谱斜率
在之前提到的脑电测量中，只有谱斜率符合关于觉醒的假设。谱斜率可靠地跟踪了所有三个组别中跨睡眠阶段的觉醒变化，尤其是在UWS中。此外，健康对照组的谱斜率在清醒阶段与MCS和UWS没有差异。详见以下详细信息。

对于跨睡眠阶段的组内比较，根据正态性结果选择了统计检验。因为Shapiro-Wilk检验表明健康对照组在清醒和REM阶段的谱斜率偏离正态性，所以对健康对照组使用了Friedman检验。Friedman检验显示健康对照组中睡眠阶段具有显著效应（χ2(2) = 32.444，p < 0.001，Kendall's W = 0.901）。使用Bonferroni校正的Conover事后比较显示，清醒期间的谱斜率显著高于N3睡眠期间（p < 0.001），而REM睡眠期间的谱斜率显著高于N3睡眠期间（p = 0.006），而清醒与REM睡眠的比较在Bonferroni校正后显示出边缘趋势（p = 0.077）。

在MCS组中，正态性假设得到满足，单因素重复测量方差分析显示睡眠阶段具有显著效应（F(2, 34) = 27.661，p < 0.001，ηp2 = 0.619）。采用Bonferroni校正的事后比较显示，谱斜率在清醒阶段最高，其次是快速眼动睡眠和非快速眼动第三期（N3）睡眠，且清醒与快速眼动睡眠之间存在显著差异（p < 0.001），清醒与N3睡眠之间存在显著差异（p < 0.001），快速眼动睡眠与N3睡眠之间也存在显著差异（p = 0.011）。在UWS组中，由于部分患者存在特定睡眠阶段的缺失数据（补充信息，表S2），采用单因素协方差分析（ANCOVA）对睡眠阶段进行比较，并将年龄作为协变量。结果显示清醒、快速眼动睡眠和N3睡眠之间存在显著差异（F(2, 37) = 9.259，p < 0.001，ηp2 = 0.334）。采用Bonferroni校正的事后分析显示，清醒阶段的谱斜率也显著高于快速眼动睡眠（p = 0.039）和N3睡眠（p < 0.001）（图3A）。

图3 觉醒相关谱斜率趋势

(A) 健康对照组（HC）、MCS和UWS组中各睡眠阶段的谱斜率分布小提琴图。

(B) 各睡眠阶段在健康对照组、MCS和UWS组间的谱斜率分布小提琴图。

白点表示均值，箱体边界代表上四分位数和下四分位数。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001。详细的统计信息见补充信息表S3-S7。

此外，采用单因素协方差分析对每个睡眠阶段中各组（健康对照组、MCS和UWS）之间的谱斜率进行比较，并以年龄作为协变量。结果显示，清醒阶段各组之间无显著差异，但快速眼动和N3阶段各组之间存在显著差异（快速眼动：F(2, 45) = 4.02，p = 0.025，ηp2 = 0.152；N3：F(2, 44) = 8.271，p < 0.001，ηp2 = 0.273）。采用Bonferroni校正的事后比较显示，在快速眼动阶段，健康对照组的谱斜率显著高于UWS组（p = 0.04）；健康对照组与MCS组之间存在边际显著差异（p = 0.059），而MCS组与UWS组之间未见差异。在N3睡眠阶段，健康对照组的谱斜率显著低于MCS组（p < 0.001）和UWS组（p = 0.014）；MCS组与UWS组之间未见显著差异（图3B）。详细统计信息见补充信息表S3-S7。

为进一步检验病因的影响，我们在MCS和UWS患者中比较了缺氧与无缺氧亚组之间的谱斜率（MCS：1/17；UWS：5/11）。在UWS缺氧亚组中，Kruskal-Wallis检验显示睡眠阶段具有显著效应（p = 0.033）。事后比较表明，清醒阶段的谱斜率高于N3阶段（p = 0.039）。相比之下，UWS无缺氧亚组未显示显著的阶段性差异（p = 0.08）。在MCS无缺氧亚组中，重复测量方差分析显示谱斜率在各睡眠阶段间也存在显著差异（F(2, 32) = 24.631，p < 0.001，ηp2 = 0.606）。采用Bonferroni校正的事后检验表明，清醒阶段的谱斜率高于快速眼动睡眠（p = 0.02）和N3睡眠（p < 0.001），快速眼动睡眠阶段的谱斜率高于N3睡眠（p = 0.012）（图S1A）。最后，采用Mann-Whitney U检验进行组间比较，结果显示在无缺氧条件下，清醒、快速眼动和N3阶段MCS组与UWS组之间均无显著差异（图S1B）。这些结果表明，谱斜率主要反映意识的觉醒维度，而非感知维度。

作为感知指标的脑电图复杂性测量

与谱斜率不同，复杂性指标（谱熵和Lempel-Ziv复杂性）符合感知假说。健康对照组和MCS组在清醒阶段和快速眼动睡眠期间的复杂性高于N3睡眠，而UWS组在各睡眠阶段间无波动。此外，健康对照组和MCS组在清醒状态和快速眼动睡眠期间的复杂性均高于UWS组。

图4A展示了各组内谱熵在各睡眠阶段的变异情况。单因素重复测量方差分析显示，健康对照组和MCS组中谱熵在各睡眠阶段间存在显著差异（健康对照组：F(1.283, 21.803) = 66.073，p < 0.001，ηp2 = 0.795；MCS组：F(1.490, 25.328) = 21.773，p < 0.001，ηp2 = 0.562）。采用Bonferroni校正的事后比较显示，在健康对照组中，清醒阶段的谱熵显著高于N3睡眠（p < 0.001），快速眼动睡眠阶段的谱熵也显著高于N3睡眠（p < 0.001）。在MCS组中，采用Bonferroni校正的事后检验显示，清醒阶段的谱熵显著高于N3睡眠（p < 0.001），快速眼动睡眠阶段的谱熵也显著高于N3睡眠（p < 0.001）。最重要的是，在UWS组中，各睡眠阶段间未见显著差异，表明在觉醒-睡眠周期中缺乏感知调节，而觉醒仍独立波动。

图4 谱熵和Lempel-Ziv复杂性趋势

(A) 健康对照组、MCS和UWS组数据合并后，清醒、N3和快速眼动阶段平均谱熵的变异情况。

(B) 健康对照组、MCS和UWS组中各睡眠阶段的谱熵分布小提琴图。

(C) 健康对照组、MCS和UWS组数据合并后，清醒、N3和快速眼动阶段平均Lempel-Ziv复杂性的变异情况。

(D) 各睡眠阶段在健康对照组、MCS和UWS组间的Lempel-Ziv复杂性分布小提琴图。

白点表示均值，箱体边界代表上四分位数和下四分位数。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001。详细的统计信息见补充信息表S3-S7。

为进一步验证谱熵作为感知指标的作用，采用单因素协方差分析对每个睡眠阶段中各组（健康对照组、MCS和UWS）之间的谱熵进行比较，并以年龄作为协变量以控制潜在的年龄相关效应（图4B）。单因素协方差分析结果显示，在清醒状态、快速眼动睡眠和N3睡眠各组之间均存在显著差异（清醒状态：F(2, 48) = 26.139，p < 0.001，ηp2 = 0.521；快速眼动睡眠：F(2, 45) = 22.422，p < 0.001，ηp2 = 0.499；N3睡眠：F(2, 44) = 8.008，p = 0.001，ηp2 = 0.267）。采用Bonferroni校正的事后比较显示，在清醒阶段，健康对照组的谱熵显著高于MCS组（p < 0.001）和UWS组（p < 0.001），MCS组的谱熵也显著高于UWS组（p = 0.006）。在快速眼动睡眠和N3睡眠阶段，健康对照组的谱熵显著高于MCS组（快速眼动睡眠：健康对照组 vs. MCS组，p < 0.001；N3睡眠：健康对照组 vs. MCS组，p = 0.008）和UWS组（快速眼动睡眠：健康对照组 vs. UWS组，p < 0.001；N3睡眠：健康对照组 vs. UWS组，p = 0.002）。MCS组与UWS组之间未见显著差异。

对于Lempel-Ziv复杂性，这一广泛使用的信号复杂性度量指标，单因素重复测量方差分析显示健康对照组中睡眠阶段具有显著效应（F(1.455, 24.743) = 127.414，p < 0.001，ηp2 = 0.882）。由于Shapiro-Wilk检验表明MCS组N3阶段的Lempel-Ziv复杂性偏离正态性，对MCS组采用了Friedman检验，结果显示睡眠阶段具有显著效应（χ2(2) = 26.333，p < 0.001，Kendall's W = 0.731）。如图4C所示，事后比较显示，在健康对照组中，清醒和快速眼动睡眠阶段的Lempel-Ziv复杂性均高于N3睡眠（清醒 vs. N3睡眠：p < 0.001；快速眼动睡眠 vs. N3睡眠：p < 0.001）。在MCS组中，采用Bonferroni校正的Conover事后比较显示，清醒和快速眼动睡眠阶段的Lempel-Ziv复杂性均高于N3睡眠（清醒 vs. N3睡眠：p < 0.001；快速眼动睡眠 vs. N3睡眠：p = 0.004）。然而，在UWS组中，以年龄为协变量的单因素协方差分析显示各睡眠阶段间无显著差异，表明在睡眠-觉醒周期中缺乏感知调节。

如图4D所示，以年龄为协变量的单因素协方差分析结果显示，清醒、快速眼动和N3阶段各组之间存在显著差异（清醒：F(2, 48) = 27.608，p < 0.001，ηp2 = 0.535；快速眼动：F(2, 45) = 25.246，p < 0.001，ηp2 = 0.529；N3：F(2, 44) = 4.154，p = 0.022，ηp2 = 0.159）。采用Bonferroni校正的事后比较显示，在清醒和快速眼动阶段，健康对照组的Lempel-Ziv复杂性显著高于MCS组（清醒：p < 0.001；快速眼动：p < 0.001）和UWS组（清醒：p < 0.001；快速眼动：p < 0.001），MCS组的Lempel-Ziv复杂性也显著高于UWS组（清醒：p = 0.045；快速眼动：p = 0.026）。在N3阶段，仅健康对照组的Lempel-Ziv复杂性显著高于UWS组（p = 0.021）。详细统计信息见补充信息表S3-S7。

基于脑电图觉醒和感知指标的睡眠分期

利用独立健康参与者睡眠数据集（睡眠数据集2），我们进一步评估了所识别的脑电图指标在独立数据集中是否能捕捉与觉醒和感知相关的睡眠-觉醒变异。图5A展示了留一被试交叉验证（LOSO-CV）分析的混淆矩阵，展示了三种分类性能：同时使用觉醒和感知相关特征、仅使用觉醒相关特征以及仅使用感知相关特征。具体而言，组合特征集取得了最高的总体准确率（ACC = 0.80）、宏平均F1分数（MF1 = 0.7745）和Cohen's Kappa（K = 0.6864）。相比之下，仅使用觉醒相关特征的分类性能最低（ACC = 0.6481，MF1 = 0.6481，K = 0.4695），而仅使用感知特征集取得了中等性能（ACC = 0.7617，MF1 = 0.7344，K = 0.6316）。

图5 睡眠分期性能评估与意识诊断

(A) 独立健康参与者睡眠数据集（睡眠数据集2）中不同特征组合下的交叉验证分类性能。左：采用留一被试交叉验证（LOSO-CV），联合使用觉醒相关（谱斜率）和感知相关特征（谱熵、Lempel-Ziv复杂性）。中：觉醒相关特征（谱斜率）。右：感知相关特征（谱熵、Lempel-Ziv复杂性）。

(B) 感知驱动的诊断性能：上行，脑机接口任务数据集1（左）和脑机接口任务数据集2（右）的混淆矩阵；下行，受试者工作特征（ROC）曲线（脑机接口任务数据集1 AUC：0.84，脑机接口任务数据集2 AUC：0.92），证实了MCS-UWS谱熵的稳健可分性。

(C) 觉醒驱动的诊断性能：上行，相同数据集的混淆矩阵；下行，ROC曲线（数据集1 AUC：0.52，数据集2 AUC：0.46），接近随机判别水平。

基于脑电图感知指标的意识检测

为进一步确认脑电图指标（感知和觉醒）与意识的关系，我们在两个独立的障碍性意识障碍组（均包含UWS和MCS）中进行了分类分析。两组均具有脑机接口任务期间的脑电图数据集（详见"实验方法"）。感知相关特征（谱熵和Lempel-Ziv复杂性）在UWS和MCS分类中的性能显著高于觉醒相关特征（谱斜率），后者无法区分UWS和MCS（见图5B和5C）。具体而言，对于脑机接口任务数据集1，感知相关特征的准确率为82.05%，曲线下面积（AUC）为0.84；对于脑机接口任务数据集2，准确率为90%，AUC为0.92。相比之下，觉醒相关特征（谱斜率）的性能明显较差，在脑机接口任务数据集1中准确率为51.28%，AUC为0.52；在脑机接口任务数据集2中准确率为40%，AUC为0.46。这些发现验证了谱熵和Lempel-Ziv复杂性能够表征感知，而作为觉醒指标的谱斜率无法表征感知。

健康对照组和UWS中快速眼动睡眠的α功率降低

对健康对照组和MCS组采用单因素重复测量方差分析评估睡眠阶段的效应。结果显示，各组内α功率在各睡眠阶段间存在显著差异（健康对照组：F(1.458, 24.789) = 20.006，p < 0.001，ηp2 = 0.541；MCS组：F(1.372, 23.320) = 9.420，p = 0.003，ηp2 = 0.357）。

经过Bonferroni校正的事后比较显示，在HC组中，REM睡眠期间的alpha功率显著低于清醒状态（p < 0.001）和N3睡眠（p < 0.001）。在MCS组中，REM睡眠和N3睡眠的alpha功率均显著低于清醒状态（REM与清醒：p < 0.001；N3与清醒：p = 0.017）。然而，在UWS组中，以年龄为协变量的一元协方差分析（one-way ANCOVA）显示，各睡眠阶段之间的alpha功率无显著差异。此外，以年龄为协变量，分别对各睡眠阶段的组间alpha功率进行了以一元协方差分析比较。结果显示，在清醒、REM睡眠和N3睡眠阶段中，组间存在显著差异（清醒：F(2, 48) = 26.848，p < 0.001，ηp2 = 0.528；REM：F(2, 45) = 17.463，p < 0.001，ηp2 = 0.437；N3：F(2, 44) = 20.700，p < 0.001，ηp2 = 0.485）。经过Bonferroni校正的事后比较显示，UWS组在清醒（与HC组比较：p < 0.001；与MCS组比较：p = 0.003）和REM睡眠（与HC组比较：p < 0.001；与MCS组比较：p < 0.001）阶段的alpha功率均显著低于HC组和MCS组。此外，MCS组在清醒（p < 0.001）和N3睡眠（p < 0.001）阶段的alpha功率也显著低于HC组。详细统计结果见附表S3–S7；附图S2。

**讨论**

本研究利用不同的基于脑电图（EEG）的皮质活动指标，将觉醒与意识（awareness）区分开来。具体而言，频谱斜率可作为觉醒的EEG指标，而复杂度指标（包括频谱熵和Lempel-Ziv复杂度）则可作为意识的EEG指标。通过研究UWS患者的睡眠-觉醒EEG变化，本研究描述了睡眠-觉醒周期中与觉醒相关的波动，并提供了证据表明频谱斜率能够追踪UWS患者睡眠阶段依赖的觉醒变化，其模式与在健康人中观察到的模式部分相似。这些发现有力地支持了意识的双成分假说。

**频谱斜率作为觉醒的指标。** 在过去二十年中，大多数研究认为UWS患者在清醒状态下的觉醒水平与健康参与者相似。然而，支持这一假设的证据仅来自行为层面的睡眠-觉醒周期，以及通过正电子发射断层扫描（PET）显示的UWS患者完整的大脑干活动。由于缺乏来自皮质活动的证据，这些发现无法排除UWS患者的脑觉醒水平是否与健康个体相似的疑虑。为了发现觉醒的EEG指标，近期研究采用了功能性磁共振成像（fMRI）或EEG，并采集了来自多种意识改变状态（即N3睡眠、深度麻醉、REM睡眠和UWS）的信号。然而，在这些研究中，所有基于这些状态之间的对比都无法排除两个成分之间的相互影响。例如，虽然REM睡眠具有相对较高的意识和较低的觉醒，但其在觉醒和意识两个指标上的数值仍高于N3睡眠。在本研究中，遵循UWS的临床表征——保留觉醒但缺乏可重复的行为意识证据——其睡眠-觉醒周期可能纯粹反映觉醒的波动。与此假设一致，我们的结果显示频谱斜率可以反映不同睡眠阶段之间的觉醒波动。

频谱斜率反映了EEG信号中的1/f动力学特征，即高频活动的功率相对于低频活动降低，这一特征在意识方面被认为具有重要意义。先前的研究表明，全身麻醉状态下频谱斜率值比清醒状态更为负值。在睡眠研究文献中，在较宽的频率带（0.5–45 Hz）内，N3睡眠的频谱斜率值比REM睡眠和清醒状态更为负值，而REM睡眠的频谱斜率值比清醒状态更为负值。本研究在健康参与者中得到了与先前研究一致的结果。本研究最重要的发现是，UWS患者在不同睡眠阶段之间的频谱斜率波动与健康参与者相似。在清醒阶段，UWS、MCS和HC组之间频谱斜率无显著差异，且在两个独立数据集中无法区分MCS和UWS。尽管先前研究表明缺氧对UWS和MCS患者的EEG信号有影响，但本研究显示，UWS患者的缺氧患者在N3睡眠阶段的频谱斜率也比清醒状态更为负值，与非缺氧的UWS患者相似。这些关于频谱斜率的结果符合对觉醒EEG指标的假设。

**皮质活动的复杂度指标反映意识。** 复杂性与意识之间的联系在过去十年中一直是研究的焦点。根据整合信息理论（IIT）及其相似理论，需要最低限度的皮质活动复杂度来支持意识体验（例如意识）。事实上，一些先前的研究报告称，在缺乏意识时皮质活动的复杂度会降低。频谱熵和Lempel-Ziv复杂度这两种常用的复杂度测量方法在无意识状态（UWS、N3睡眠和麻醉）中的数值均低于有意识状态（清醒和REM睡眠）。除上述先前研究外，我们的结果显示，在UWS患者中频谱熵和Lempel-Ziv复杂度并不随睡眠-觉醒周期波动，而觉醒（如频谱斜率）则会发生波动，且可在两个独立数据集中区分MCS和UWS患者。这些结果进一步澄清了复杂度与意识之间的关系。在本研究中，尽管大多数有意识状态的频谱熵值显著高于无意识状态，但MCS患者在REM睡眠期间的频谱熵值高于UWS患者（但不显著）。这表明在少数情况下单一测量可能不可靠，结合多种测量将在临床上更有效地区分MCS和UWS。最后，在N3睡眠阶段，频谱熵和Lempel-Ziv复杂度在HC组中的数值均高于UWS组。这可能表明，在无意识的健康大脑中存在更多的信息处理，而UWS大脑中则较少，这一点得到了先前关于N3睡眠期间认知处理的研究的支持。

UWS和MCS在夜间均有可检测的睡眠阶段。然而，与健康人相比，他们的睡眠结构发生了改变。与MCS患者相比，UWS患者的睡眠时间更短。此外，62.5%的UWS患者具有所有睡眠阶段，而所有MCS患者都具有所有睡眠阶段（图2；表S2）。这些结果与先前研究一致。除UWS和MCS意识水平之间睡眠结构的差异外，先前研究还试图调查睡眠元素与UWS和MCS患者预后的关系，并发现睡眠结构与更好的预后之间存在正相关关系。例如，近期研究表明，睡眠纺锤波、K复合波和REM睡眠可以预测患者的好预后。形态良好的睡眠纺锤波甚至可以预测认知运动分离（CMD）患者的检测。这也表明，临床上诊断为UWS并不一定排除隐性意识或CMD，并且复杂度测量中睡眠阶段调节的缺失应被理解为群体水平的解释，而非作为每一个UWS个体缺乏意识的决定性证据。所有上述发现表明，睡眠结构可以反映剩余的脑功能，并且在UWS和MCS患者中具有重要的临床价值。本研究首次利用EEG指标（如频谱斜率）描述了睡眠-觉醒周期中纯粹的觉醒波动，扩展了当前的知识。

还检验了alpha功率与意识之间的关系，因为一些先前研究建议alpha功率可能是意识的生物标志物。与这些研究一致，我们的结果显示，HC组和MCS组在清醒阶段的alpha功率强于UWS组。此外，本研究表明UWS患者的清醒状态、REM睡眠和N3睡眠之间无差异。然而，我们的结果还显示，在HC组中清醒状态和N3睡眠的alpha功率均强于REM睡眠（见附图S2和S3），这一点也得到了先前研究的支持。考虑到REM睡眠中可能有比N3睡眠更多的意识体验（例如意识），这一结果可能表明alpha不能反映意识水平。由于封闭性综合征（locked-in syndrome）其病变位于脑干，在清醒时也表现出alpha功率降低，因此REM睡眠中alpha功率降低可能是由于脑干与皮质之间功能完整性降低所致。此外，近期一项研究发现，alpha功率仅在重度缺氧后的UWS患者中被抑制，但在其他病因中未能区分意识状态。他们认为alpha功率降低可能与弥漫性皮质损伤有关。综合来看，alpha功率可能不能反映意识水平。

有几个问题需要注意。首先，虽然大多数先前研究表明REM睡眠可能比N3睡眠具有更高的觉醒水平（因为其具有更多脑活动），但另一些研究显示，在较窄的频率带（30–45 Hz或30–50 Hz）内，REM睡眠的频谱斜率值比非REM睡眠和清醒状态更为负值。本研究在健康参与者中重现了这一发现，但在UWS中未能重现（见附图S4和S5）。这表明窄带频谱斜率可能不能作为觉醒的生物标志物。其次，与健康人相比，UWS和MCS在N3睡眠中频谱斜率降低更为明显，这可能与大脑干和基底前脑功能完整有关。最后，少数研究指出UWS患者在静息清醒状态下频谱斜率比MCS更为负值。一个可能的原因是UWS患者在静息状态下可能从清醒状态向睡眠状态的转换更多，导致频谱斜率比MCS患者更低。在本研究中，我们使用了患者执行主动任务的EEG数据，以最大限度地减少意识水平改变的影响。结果显示频谱斜率未能区分UWS和MCS，表明频谱斜率不能反映意识水平（图5C）。

总之，通过结合UWS和HC患者在睡眠-觉醒周期中的脑信号，我们发现频谱斜率符合意识双成分理论中关于觉醒的假设，填补了觉醒神经机制的空白，并确认了复杂度测量（如频谱熵和Lempel-Ziv复杂度）与意识之间的关系。这些结果有力地支持了意识的双成分理论。此外，结果表明，未来研究觉醒与意识之间的相互作用对于理解意识的神经基质具有重要意义。

**研究的局限性**

本研究存在若干局限性。首先，睡眠发现数据集的样本量较小。昼夜或延长PSG研究在DOC患者中通常包括相对较小的临床队列，因为在这类人群中获取高质量的睡眠记录存在困难。未来具有更大规模独立DOC睡眠队列的研究将有助于进一步确立这些发现的普适性。其次，虽然我们排除了24小时内近期使用巴比妥类药物、抗精神病药或抗抑郁药的患者，并检查了与病因相关的效应，但慢性用药，如抗癫痫药或镇静药，在本数据集中无法完全控制。由于这些药物可能影响EEG频谱和睡眠结构，与药物相关的效应应在未来更大规模的DOC睡眠队列中更系统地评估。第三，我们的频谱斜率分析基于宽带对数-对数功率谱密度（PSD）拟合，并未明确将周期性振荡峰值和非周期性背景分开进行参数化。

尽管该方法沿用了以往的光谱斜率研究，未来采用专门的光谱参数化方法的工作可以进一步将观测到的睡眠阶段效应中周期性成分与非周期性成分分离开来。

资源可得性

主要联系人

有关资源与试剂的更多信息及索取请求应发送至主要联系人李元青（[e-mail]），其将予以满足。

材料可得性

本研究未产生新的、独特的试剂。

数据与代码可得性

• 支持本研究中图表及统计摘要的已处理源数据已存档于Zenodo，并自发表之日起公开获取（Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.21831514）。登录号列于关键资源表中。

• 分析代码已存档于GitHub并公开获取（GitHub: https://github.com/amdli/Distinguishing-cortical-indexes-of-arousal-and-awareness）。登录号列于关键资源表中。

• 重新分析本论文所报告数据所需的任何附加信息，均可在向主要联系人提出合理请求后获得。

致谢

我们感谢所有参与者对本研究的贡献。本工作得到以下项目的支持：脑科学与类脑智能技术国家重点研发计划（项目编号：2022ZD0208900）、广东省重点研发计划（项目编号：2018B030339001）、广东省基础与应用基础研究基金（项目编号：2024A1515011429和2023A1515140100）、国家自然科学基金（项目编号：32371098）、广东省脑认知与人的发育研究中心（项目编号：2024B0303390003）以及广州市高层次人才计划（项目编号：2024D02J0008）。

作者贡献

Y. Li构思了本研究的框架。P.Q.、M.L.和Y. Li设计了研究方法。M.L.、P.Q.、J.P.、H.W.和Y. Li开展调查研究。M.L.、Y.H.、J.P.、X.B.、Y.Y.、A.L.、Y. Liu、X.Y.、J.H.和D.C.进行数据整理。M.L.执行了正式分析。M.L.、J.H.、H.W.和F.W.贡献了数据可视化、数据核查及稿件修订工作。Y. Li、P.Q.和J.P.负责获取资金。项目管理由P.Q.和Y. Li负责。Y. Li、P.Q.和Y.H.提供指导。M.L.和P.Q.起草了稿件，P.Q.、J.P.、M.L.、F.W.和Y. Li进行了关键性修订。

利益冲突声明

作者声明不存在竞争性利益冲突。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
---|---|---
已存档数据（图表及统计摘要的已处理源数据） | 本文；Zenodo | https://doi.org/10.5281/zenodo.21831514
分析代码 | 本文；GitHub | https://github.com/amdli/Distinguishing-cortical-indexes-of-arousal-and-awareness
软件与算法 | |
Python 3.9.6 | Python Software Foundation | https://www.python.org
MNE-Python v1.6.0 | MNE Developers | https://mne.tools
NumPy v1.22.4 | NumPy Developers | https://numpy.org
scikit-learn v1.1.3 | scikit-learn Developers | https://scikit-learn.org
IBM SPSS Statistics v27.0 | IBM Corp. | https://www.ibm.com/products/spss-statistics

实验模型与研究参与者详情

睡眠数据集1

发现数据集包括52名参与者，其中34名慢性意识障碍（DOC）患者和18名健康对照（HC）。数据于2023年2月至2024年1月在广东省工伤康复医院采集。在DOC患者中，16名被诊断为植物状态（UWS，平均年龄：51.68 ± 11.05岁；男/女：9/7），18名被诊断为微意识状态（MCS，平均年龄：51.27 ± 9.63岁；男/女：15/3）。健康对照组平均年龄为41.0 ± 9.99岁（男/女：8/10）。临床诊断使用修订版昏迷恢复量表（CRS-R）确认，分别在实验前一周及实验当天各进行一次评估。在每个评估期内，由两名经验丰富的医师进行至少两次CRS-R评估。

患者纳入标准如下：被诊断为UWS或MCS，年龄介于18至70岁之间（以最大限度减少年龄依赖性效应对睡眠的影响）。排除标准包括：病情严重或不稳定、存在与意识障碍无关的中枢神经系统损伤、或在24小时内使用过巴比妥类药物、抗精神病药或抗抑郁药。

睡眠数据于夜间通过Compumedics Grael Profusion多导睡眠监测系统（版本4.5，构建500，Compumedics Limited）采集。平均记录时长为8.402 ± 0.54小时。记录内容包括脑电图（EEG）、眼电图（EOG）和肌电图（EMG）信号。EEG数据按照国际10–20系统（F3、F4、C3、C4、O1、O2）以256 Hz的采样频率记录。同步采集EOG和EMG信号以提供全面的睡眠监测。视频录制与EEG同步，用于标注关键行为事件（睁眼时刻、自主运动时的静止与躁动，以及护理引起的外源性运动）。电极阻抗保持在5 KΩ以下。

已获得伦理批准（批准号：AF/SC-07/2020.03），并依据《赫尔辛基宣言》从法定监护人处获得知情同意。详细信息可查阅补充信息表S8。

睡眠数据集2

该独立睡眠数据集包括来自华南理工大学37名健康志愿者（平均年龄：26.45 ± 8.11岁，男/女比例：20/17）的记录，于2018年6月至2023年1月间招募。睡眠数据于夜间多导睡眠监测期间使用SynAmps2放大器（Compumedics, Neuroscan, Inc., 澳大利亚）和符合国际10–20系统的32通道EEG帽采集。平均记录时长为7.02 ± 1.34小时。EEG信号采样频率为250 Hz，电极阻抗保持在5 KΩ以下。

脑机接口（BCI）任务数据集1

本研究所用数据集来源于DOC患者进行的视听识别任务的脑机接口（BCI）实验。该数据集先前已在一项研究BCI评估在DOC患者中预后意义的研究中发表，包含78名DOC患者的EEG记录，其中包括45名UWS患者（平均年龄：39.06 ± 14.17岁，男/女：31/14）和33名MCS患者（平均年龄：36.24 ± 14.48岁，男/女：20/13）。数据于2014年10月至2018年8月间在中国人民解放军广州军区总医院，通过物品选择任务采集，旨在检测意识觉知。EEG信号使用符合国际10–20系统的32通道EEG帽记录，采样频率为250 Hz。使用了三种BCI：基于照片刺激的P300与稳态视觉诱发电位（SSVEP）混合BCI（照片范式）、基于视觉数字刺激的P300与SSVEP混合BCI（数字范式）以及基于视听数字刺激的视听BCI（视听范式）。35名患者参加了基于照片范式的实验，13名参加了基于数字范式的实验，30名参加了基于视听范式的实验。在本研究中，我们重新利用该数据集来验证觉知的EEG指标。详细信息可查阅补充信息表S9。

BCI任务数据集2

BCI任务数据集2采集自一项视听多模态BCI实验，该实验旨在整合P300和听觉稳态反应（ASSR）以评估DOC患者的意识觉知。数据于2022年10月至2023年4月间在中国广东省工伤康复医院采集，使用SynAmps2放大器（Compumedics, Neuroscan, Inc., 澳大利亚）。尽管该数据集与睡眠数据集1来自同一家医院，但采集自不同的DOC患者队列。

该数据集包括10名DOC患者，其中6名为UWS患者（平均年龄：49.17 ± 8.45岁，男/女：4/2），4名为MCS患者（平均年龄：51.75 ± 19.35岁，男/女：3/1）。使用符合国际10–20系统的32通道EEG帽进行EEG记录，记录时长为5分钟，采样频率为250 Hz。为确保信号保真度，电极阻抗保持在5 KΩ以下。在每个试验中，两张面部照片以随机顺序闪现，当每张照片闪现时，同侧耳塞播放相应声音。与BCI任务数据集1相同，我们重新利用该数据集来验证觉知的EEG指标。详细信息可查阅补充信息表S9。

方法细节

睡眠分期

多导睡眠记录（EEG、EOG、EMG）被分割为30秒的片段进行睡眠分期评分。鉴于UWS和MCS患者睡眠模式的异常性，健康个体所使用的标准睡眠分期标准无法直接适用，而必须针对UWS和MCS患者的睡眠模式进行调整。在本研究中，我们应用了这些调整后的标准对UWS和MCS患者进行睡眠分期评分。

具体而言，鉴于UWS和MCS患者可能表现出局灶性间歇性节律性δ活动，可能被误认为与睡眠相关的δ波，因此所有六个EEG电极（F3、F4、C3、C4、O1、O2）均用于视觉睡眠分期评分以确保准确判读。觉醒期（Wake）定义为EEG频率相对较高、存在眨眼（来自视频）以及高肌张力。N1睡眠在EEG出现普遍变慢、眨眼消失并伴有肌活动降低时评分（眼球滚动运动被视为可选指标）。N2睡眠基于存在K复合波以及偶见的典型睡眠纺锤波（持续时间0.5–3秒，振幅20-100 μV，频率11–16 Hz）或延长的"非典型"慢纺锤波（10–12 Hz）来识别，同时伴有EEG变慢、慢波活动出现及肌张力进一步降低，前提是慢波占该片段的比例<20%。N3睡眠在>20%的片段包含跨完整皮层区域同步出现的慢波时评分。鉴于UWS和MCS患者的EEG振幅可能受各种脑外因素影响，标准高振幅慢波（>75 μV）和优势低电压慢波（<75 μV）均被视为慢波睡眠（SWS）的指标。快速眼动（REM）睡眠定义为快速低电压EEG活动伴最小肌张力，并存在肌张力低下特征，EEG特征优先于EOG特征。

所有睡眠数据均由两名专家临床神经生理学家独立评分。睡眠分期评分和觉醒识别中的分歧通过共识进行审阅和解决。不确定的片段被排除在统计分析之外以保持数据完整性。

标准睡眠结构指标

总睡眠时间（TST）定义为睡眠期间所有睡眠阶段（N1、N2、N3和REM）的累计时长。入睡后觉醒时间（WASO）测量为初始入睡后发生的所有觉醒片段的总时长。睡眠效率（SE）定义为总睡眠时间占总在床时间（TIB，即总记录时长）的百分比，计算如下：

SE(%) = TST / TIB × 100（公式1）

睡眠维持效率（SME）定义为总睡眠时间占总睡眠期时间（SPT）的百分比：

SME(%) = TST / SPT × 100（公式2）

睡眠结构完整性（SAC）定义为表现出完整睡眠结构的个体比例，其特征为睡眠期间出现所有主要睡眠阶段（N1、N2、N3和REM）。计算如下：

SAC(%) = N_complete sleep architecture / N_total × 100（公式3）

其中N_complete sleep architecture表示经历所有主要睡眠阶段的个体数量，N_total表示分析的总个体数量。

夜间觉醒优势（NWD）用于评估总觉醒时间超过总睡眠时间的个体比例。计算如下：

NWD(%) = N_wake>sleep / N_total × 100（公式4）

其中N_wake>sleep表示总觉醒时间大于其TST的个体数量。

EEG预处理

使用MNE-Python（v1.6.0）结合NumPy（v1.22.4），在Python 3.9.6环境下，对两个睡眠EEG数据集（主要发现数据集Sleep dataset1和独立睡眠数据集Sleep dataset2）及BCI任务数据集（数据集1和数据集2）严格应用了统一的预处理流程。为确保跨模态的方法学一致性，选取了六个电极（F3、F4、C3、C4、O1、O2），遵循国际10–20系统，涵盖与睡眠及任务相关神经动力学有关的额、中央及枕区。

EEG信号首先通过50 Hz陷波滤波器（4阶Butterworth）去除工频干扰，随后使用有限脉冲响应（FIR）Hamming窗滤波器进行0.5–45 Hz的带通滤波。信号随后重新参考至所有未排除通道的全局平均值，以最大限度减少长时间记录过程中电极位移产生的伪迹。伪迹剔除由专家临床神经生理学家通过视觉检查手动完成，使用±100 μV的振幅阈值等标准来识别并排除受噪声污染的片段。为减少通道间变异性，对每个通道独立施加Z分数归一化。最后，信号被降采样至100 Hz并分割为不重叠的30秒片段。

特征提取

对于发现数据集（即Sleep dataset 1；包括UWS、MCS和HC组），该数据集主要用于统计分析，特征提取仅限于三个睡眠阶段：觉醒期（高觉醒/高觉知）、REM睡眠（低觉醒/高觉知）和N3睡眠（低觉醒/低觉知），因为这些阶段最能清晰地捕捉与本研究所关注的觉醒和觉知特征相关的不同觉醒和觉知轮廓。值得注意的是，以往关注觉醒与意识的EEG研究也类似地将分析限定于这三个阶段。特征首先在片段水平计算，然后在每个受试者的每个阶段内进行平均。

对于每个受试者，三个睡眠阶段（觉醒、REM和N3）均包含超过7个片段（即每个阶段至少有3.5分钟的数据）。此外，为获得更通用的神经活动表示，在统计比较之前，特征还跨EEG通道进行了平均。相比之下，对于独立的睡眠和脑机接口（BCI）任务数据集（分别用于睡眠分期和意识诊断），每个片段被视为独立样本。

**频谱斜率**

频谱斜率是一种定量指标，用于表征功率在各频率分量上的宽带分布，此前已在睡眠、麻醉和意识研究中作为与脑状态和觉醒水平相关的电生理特征使用。

在本研究中，频谱斜率的计算方法参照了既往研究。为获得频谱斜率，我们使用Welch方法估计功率谱密度（PSD），并在对数-对数空间中拟合0.5至45 Hz范围内功率谱的线性回归线。

形式上，对于给定时域信号x(t)，使用"welch"方法计算信号x(t)的PSD，以确保稳健且平滑的谱估计。PSD表示为P(f)，其中f代表频率。然后将PSD转换为对数域：(log f, log P(f))（公式5）。此转换使对数-对数空间中频率与功率之间的关系线性化，从而能够进行更可解释的斜率计算。

在预定义频率范围（0.5–45 Hz）内，对经过对数转换的PSD值进行线性回归。频谱斜率定义为回归线的斜率：

$$\text{Slope} = \frac{\Delta \log P(f)}{\Delta \log f}$$

（公式6）

**频谱熵**

频谱熵（SEp）量化EEG功率谱分布在特定频率范围内的均匀性或峰值性。它反映了信号频率分量的随机性或可预测性程度，并提供了其正弦特性的指标。较低的SEp值表明信号由较少频率分量主导，谱功率集中在一个或几个离散频率附近，从而表现出更明显的正弦特性。相反，较高的SEp值表明存在更多频率分量且谱分布更广泛，意味着正弦特性减弱且信号复杂度增加。

在神经生理信号分析中建立的方法论基础上，我们针对每个通道和片段，在0.5–45 Hz带宽内通过三个阶段系统地实现了频谱熵的计算。

对于连续信号x(t)，公式定义如下：

$$X(f) = \int_{-\infty}^{\infty} x(t) \cdot e^{-j \cdot 2\pi f t} \, dt$$

（公式7）

每个频率分量的功率谱密度计算如下：

$$PSD(F) = |X(f)|^2$$

（公式8）

其中|X(f_k)|2表示该频率处的功率，即信号在该频率处的能量。P(f)表示频率带f的相对功率：

$$P(f) = \frac{PSD(f)}{\sum_f PSD(f)}$$

（公式9）

频谱熵（SEp）定义为：

$$SEp = -\sum_f P(f) \cdot \log(P(f))$$

（公式10）

**Lempel-Ziv复杂度**

Lempel-Ziv复杂度（LZC）通过评估时间动态和不可预测性来量化EEG信号的复杂度。在本研究中，LZC的计算方法参照了既往研究。我们采用均值符号编码方法计算LZC，即将连续EEG信号离散化，基于其在滑动窗口内的均值映射为符号表示。为确保LZC在频谱斜率的相同频率范围内计算，在计算前对EEG信号施加了0.5 Hz高通滤波器和45 Hz低通滤波器。

LZC的计算从连续信号x(t)的预处理开始，将其分割为大小为L的不重叠窗口。对于每个窗口X_i = {x_1, x_2, …, x_L}，计算窗口均值为：

$$\mu_i = \frac{1}{L} \sum_{j=1}^{L} x_j$$

（公式11）

然后使用该均值μ_i来符号化窗口。具体来说，通过将均值μ_i与预定义阈值或分箱进行比较来确定每个窗口的符号。EEG信号被转换为二进制序列S = {s_1, s_2, …, s_N}。Lempel-Ziv解析算法顺序扫描S，识别唯一的子序列。每当遇到新的、非冗余的子序列时，复杂度计数C(N)增加。为考虑序列长度依赖性，原始复杂度计数C(N)通过随机二进制序列的理论上限进行归一化：

$$LZC = \frac{C(N)}{N / \log_2(N)}$$

（公式12）

其中N是二进制序列的长度。此归一化LZC提供了EEG复杂度的稳健度量，便于在不同条件和受试者之间进行比较。

**基于机器学习的分类建模**

为评估所识别的觉醒相关和意识相关特征的有效性，我们构建了一个分类框架，设计用于两个任务：睡眠分期和意识状态诊断。主要动机是验证觉醒和意识的EEG指标的有效性。

**睡眠分期**

在本研究中，构建了三个单独的具有径向基函数（RBF）核的支持向量机（SVM）分类器，以评估不同特征域对睡眠分期的贡献。具体而言，分类器分别使用觉醒相关特征（频谱斜率）、意识相关特征（频谱熵和Lempel-Ziv复杂度）以及两种特征类型的组合（觉醒和意识的EEG指标）进行训练。所有特征均从预处理后的EEG数据中提取，涵盖觉醒、N3和REM阶段，如特征提取部分所述。

为应对睡眠阶段之间的类别不平衡，所有分类器均使用scikit-learn（v1.1.3）实现，并设置class_weight="balanced"。睡眠分期性能使用留一受试者交叉验证（LOSO-CV）进行评估，其中每次迭代将一个受试者留作测试，其余数据用于训练。在分类阶段未进行额外的特征缩放、特征选择或超参数优化。提取的特征直接用于每个LOSO折中的SVM分类。EEG信号在特征提取前对每个参与者进行独立预处理。性能指标包括总体分类准确率（ACC）、宏平均F1分数（MF1）和Cohen's Kappa系数（K）。

**意识状态诊断**

在本研究中，使用发现数据集（包括UWS和MCS组）中觉醒阶段的EEG数据，构建了两个单独的具有径向基函数（RBF）核的支持向量机（SVM）分类器。一个分类器仅使用觉醒相关特征（频谱斜率）进行训练，另一个使用意识相关特征（频谱熵和Lempel-Ziv复杂度）。特征提取流程遵循特征提取部分所述的相同流程。

为验证意识相关EEG指标在区分意识状态方面的有效性，两个分类器分别在两个外部BCI任务数据集（数据集1和数据集2）上进行独立验证，训练和测试期间的特征类型严格对齐（即觉醒分类器仅使用频谱斜率进行测试，意识分类器使用频谱熵和Lempel-Ziv复杂度）。

对于每个片段，分类器生成概率输出，指示预测意识状态（MCS或UWS）的可能性。为获得受试者级别的诊断，在所有片段上应用多数投票策略：如果分类为MCS的聚合概率超过0.5，则该受试者被标记为MCS；否则标记为UWS。分类器仅在发现数据集上进行训练，随后在两个独立的外部BCI数据集上进行评估。在分类器训练过程中未使用外部验证数据集的任何数据。这种方法考虑了意识的动态和波动性质，特别是在严重脑损伤患者中。分类性能使用准确率和受试者工作特征曲线下面积（AUC）作为主要评估指标。

**定量与统计分析**

主要统计分析使用SPSS（v27.0，IBM Corp.，Armonk，NY，USA）进行。对于HC和MCS组内跨睡眠阶段（觉醒、REM、N3）的比较，首先使用Shapiro-Wilk检验对每组和每个睡眠阶段内的每个EEG指标特征进行正态性评估。当满足正态性假设时，采用单因素重复测量方差分析。使用Mauchly检验评估球形性，当球形性假设被违反时，应用Greenhouse-Geisser校正。当Shapiro-Wilk检验表明至少一个睡眠阶段偏离正态性时，改用Friedman检验，然后进行Conover事后比较，并使用Bonferroni校正。

对于UWS组内跨睡眠阶段的比较，由于某些阶段存在缺失数据，采用以年龄为协变量的单因素协方差分析。对于组间比较（HC、MCS、UWS），对每个睡眠阶段分别进行以年龄为协变量的单因素协方差分析，以控制年龄相关效应。

为进一步检验病因相关效应（缺氧与非缺氧），进行了亚组分析。鉴于样本量相对较小，采用非参数检验（亚组内阶段比较使用Kruskal-Wallis检验，组间比较使用Mann-Whitney U检验）。对于MCS非缺氧亚组，由于样本量较大且满足正态性和球形性假设，改用重复测量方差分析。事后成对比较使用Bonferroni方法进行校正。与图表相关的详细统计信息，包括统计检验、生物学单位、检验统计量、自由度、p值以及效应量（如适用），在补充信息表S1–S7中提供。

补充信息（1）
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文档S1。图S1–S6和表S1–S11