磷酸酶动力学揭示长期荒漠植被恢复期间土壤磷恢复的机制途径

《iScience》：Phosphatase kinetics reveal mechanistic pathways of soil phosphorus recovery during long-term desert revegetation

　　

• 植被恢复提高了磷酸酶活性，改善了土壤磷的有效性
• 植被恢复土壤中较低的 Km/Vmax 比率表明酶效率更高
• 磷酸酶动力学解释了土壤磷组分变化的 67.9%
• 酶动力学见解支持沙漠中磷的可持续管理

摘要
磷（P）限制制约了干旱地恢复，但磷酸酶动力学如何调节土壤磷恢复尚不清楚。我们定量分析了腾格里沙漠三种沙漠恢复类型（流动沙丘、31 年人工植被恢复沙漠和自然植被）中磷组分以及碱性单磷酸酶（PM）、磷酸二酯酶（PD）和无机焦磷酸酶（IP）的活性和动力学特征。植被恢复增加了总磷、有机磷和有效磷，并增强了 PM 和 PD 活性、底物亲和力和催化效率，表现为较低的 Km 和 Km/Vmax。多元分析表明，磷酸酶动力学特征解释了磷组分变化的 67.9%。PM 和 PD 主要与有机磷矿化相关，而 IP 动力学与钙结合磷组分联系更紧密。这些结果揭示了互补的磷酸酶途径在沙漠植被恢复期间调节磷周转，并确定酶动力学特征作为干旱地恢复中生化恢复的潜在过程性指标。

图解摘要
引言
磷（P）是植物生长和微生物代谢的基本营养物质，在能量转移、信号转导以及核酸和磷脂的合成中起着核心作用。然而，在干旱和半干旱生态系统中，磷的有效性通常受到与钙、铁和铝吸附和沉淀的限制，这些形成了矿物结合的磷库，植物和微生物仅能部分利用。这种有限的磷有效性可能会限制微生物活性，减缓植物定殖，并制约退化沙漠生态系统中土壤肥力的恢复。因此，了解土壤磷如何从相对稳定的库转化为生物可利用形式，对于评估养分恢复和指导干旱地生态恢复至关重要。
植被恢复被广泛用于修复退化的沙漠生态系统，可以改善土壤稳定性、有机质积累、微生物活性和养分保持。随着植物群落的发展，来自凋落物、根系和根外分泌的有机输入可以改变土壤磷库的数量和组成。有机磷、有效磷和钙结合无机磷组分，包括磷酸二钙（Ca2-P）和磷酸八钙（Ca8-P），可能会沿着恢复梯度发生显著变化。这些变化与土壤磷酸酶密切相关，后者催化有机磷化合物的矿化并参与酶介导的磷周转。在更长的恢复期内，植被发展可能不仅会增加酶活性，还可能重组不同磷酸酶类型的功能角色，从而影响磷保留、矿化或活化的途径。然而，这些酶介导的过程在长期沙漠植被恢复期间调节磷恢复的程度尚不清楚。
土壤磷酸酶是磷循环的关键生化调节因子。碱性单磷酸酶（PM）水解磷酸单酯，碱性磷酸二酯酶（PD）作用于核酸和磷脂衍生的底物等磷酸二酯化合物，无机焦磷酸酶（IP）水解无机焦磷酸。这些酶具有不同的底物特异性，因此可能代表不同的磷转化途径。在钙结合磷组分丰富的碱性沙漠土壤中，磷酸酶介导的过程对于将生物磷需求与有机磷和矿物结合磷库的再分配联系起来可能尤为重要。然而，大多数恢复研究仅关注磷酸酶活性，而酶活性提供的关于酶 - 底物亲和力、催化能力和功能效率的信息有限。
酶动力学参数提供了关于磷酸酶功能的更机制化的视角。在 Michaelis-Menten 框架下，最大反应速率（Vmax）反映了底物饱和条件下的催化能力，而米氏常数（Km）反映了表观底物亲和力。比率 Km/Vmax 可以作为催化效率的反向指标，数值越低表示在测定条件下酶 - 底物相互作用越高效。这些动力学特征对土壤 pH 值、有机质输入、底物可用性、微生物群落组成和环境压力敏感。因此，它们可能提供关于微生物和酶系统如何应对植被恢复的过程性信息。然而，很少有研究将磷酸酶动力学与详细的磷分级整合，以识别长期沙漠植被恢复中土壤磷恢复的酶特异性途径。
为了解决这一差距，我们研究了土壤磷循环如何随着沙漠恢复类型梯度（包括流动沙丘、植被恢复沙漠和自然植被）中的磷酸酶活性和动力学特征而变化（图 1）。我们关注两个机制性问题：(1) 植被恢复是否增强了 PM、PD 和 IP 的活性；(2) 这些酶的动力学特征（包括 Vmax、Km 和 Km/Vmax）是否与土壤磷组分的变化相关。我们假设长期植被恢复会增强磷酸酶活性并改善酶催化效率，表现为较低的 Km 和 Km/Vmax 值，从而促进有机磷矿化以及有效磷和钙结合磷组分的再分配。为验证这些假设，我们将磷酸酶活性和动力学测定与连续磷分级、冗余分析、方差分解和偏最小二乘结构方程模型相结合。这种综合方法使我们能够识别磷转化的酶特异性途径，并评估磷酸酶动力学特征作为干旱地恢复过程中土壤生化恢复的潜在过程性指标。

图 1 腾格里沙漠的研究地点和恢复类型梯度
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(A–C) 本研究使用的三种恢复类型的代表性照片和示意图：(A) 流动沙丘 (MD)，特征是沙粒活动频繁、植被稀疏和生物输入最少；(B) 植被恢复沙漠 (RD)，建立于 1992 年，经过约 31 年的植被恢复后稳定，主要以锦鸡儿 (Caragana korshinskii) 和冷蒿 (Artemisia ordosica) 为主；(C) 自然植被 (NV)，代表具有本地植物群落且直接人为干扰较少的相对稳定的沙漠生态系统。下方的示意图说明了从流动沙丘到植被恢复沙漠和自然植被的空间恢复类型梯度，该梯度用于评估长期干旱地恢复过程中土壤磷组分、磷酸酶活性和酶动力学特征的变化。

结果
土壤磷组分在沙漠恢复类型间存在差异
土壤磷组分在三种沙漠恢复类型中差异显著：流动沙丘 (MD)、31 年植被恢复沙漠 (RD) 和自然植被 (NV)。与 MD 相比，RD 显示出显著较高的有效磷 (A-P) 和有机磷 (Or-P) (p < 0.05; 图 2A)，总磷 (T-P) 和 Ca10-P (p < 0.05; 图 2B)，以及 Ca2-P 和 Ca8-P (p < 0.05; 图 2C)。这些结果表明长期植被恢复后磷积累显著。RD 中的 Fe-P 显著低于 MD (p < 0.05; 图 2C)，表明植被恢复不仅改变了总磷积累，还改变了磷在矿物结合组分中的分布。

图 2 三种沙漠恢复类型中磷组分的变化
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(A) A-P (有效磷) 和 Or-P (有机磷): 与 MD 相比，RD 和 NV 显示出显著较高的 A-P 和 Or-P 浓度。
(B) T-P (总磷) 和 Ca10-P (钙结合磷): RD 土壤的 T-P 和 Ca10-P 水平高于 MD 和 NV。
(C) O-P, Ca2-P, Ca8-P, Al-P 和 Fe-P: NV 土壤的 O-P, Ca8-P 和 Fe-P 水平最高，而 MD 在大多数组分中显示最低浓度。数据以平均值 ± 标准误表示 (n = 3 个生物学重复)。
该图显示了流动沙丘 (MD, 红色柱)、植被恢复沙漠 (RD, 蓝色柱) 和自然植被 (NV, 黄色柱) 土壤中不同磷组分的浓度。T-P, 总磷；A-P, 有效磷；Or-P, 有机磷；Ca2-P, 磷酸二钙；Ca8-P, 磷酸八钙；Ca10-P, 磷灰石磷；Fe-P, 铁结合磷；Al-P, 铝结合磷；O-P, 闭塞磷。
与 NV 相比，RD 的 T-P 和 Or-P 浓度相似，但 A-P, Ca2-P, Ca8-P 和 Fe-P 浓度显著较低 (p < 0.05; 图 2A–2C)。相反，RD 中的 Ca10-P 显著高于 NV (p < 0.05)，表明在植被恢复土壤中，更大比例的磷保留在相对稳定的钙结合形式中。总体而言，31 年人工植被恢复沙漠的土壤磷状况较流动沙丘有显著改善，但生物可利用和中等活化的磷组分尚未完全与自然植被趋同。

植被恢复对 PM 和 PD 活性的增强作用强于 IP 活性
磷酸酶活性在恢复类型梯度和底物浓度上有所不同，表现出酶特异性响应 (图 3; 表 1)。对于碱性单磷酸酶 (PM) 和磷酸二酯酶 (PD)，活性随底物浓度增加而增加，并在 125 mmol L?1 时达到最高值。在 RD 中，PM 活性达到 0.723 μmol g?1 h?1，超过 MD (0.297 μmol g?1 h?1) 的两倍，且接近 NV 观察到的水平 (0.717 μmol g?1 h?1) (图 3A)。PD 表现出相似的模式，RD 和 NV 中的活性显著高于 MD (图 3B)。

图 3 三种沙漠恢复类型中随底物浓度增加磷酸酶活性的变化
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(A) PM: 在所有底物浓度下，RD 和 NV 土壤的 PM 活性均显著高于 MD。
(B) PD: 观察到相似的趋势，RD 和 NV 的 PD 活性高于 MD。
(C) IP: 在较高底物浓度下，NV 土壤显示最高的 IP 活性，RD 紧随其后，而 MD 始终显示最低的活性。
该图显示了 MD (红色圆圈)、RD (蓝色圆圈) 和 NV (黄色圆圈) 土壤中三种磷酸酶在不同底物浓度下的酶活性。MD, 流动沙丘；RD, 植被恢复沙漠；NV, 自然植被；PM, 碱性单磷酸酶；PD, 碱性磷酸二酯酶；IP, 无机焦磷酸酶。数据以平均值 ± 标准误表示 (n = 3 个生物学重复)。

| 地点 | PM (μmol.g-1 h-1) | PD (μmol.g-1 h-1) | IP (μmol.g-1 h-1) |
| :--- | :--- | :--- | :--- |
| **底物浓度 (25–125 mmol L?1)** | **底物浓度 (25–125 mmol L?1)** | **底物浓度 (50–250 mmol L?1)** | |
| MD | 0.068–0.297 | 0.044–0.154 | 0.023–0.103 |
| RD | 0.605–0.723 | 0.382–0.515 | 0.031–0.147 |
| NV | 0.502–0.717 | 0.397–0.521 | 0.036–0.182 |
| **双因素方差分析** | **SC F = 194.23, ???p < 0.001** | **F = 115.39, ???p < 0.001** | **F = 119.02, ???p < 0.001** |
| **RT** | **F = 195.16, ???p < 0.001** | **F = 164.01, ???p < 0.001** | **ns** |

表 1 三种沙漠恢复类型中磷酸酶活性的变化
注：此表显示了碱性单磷酸酶 (PM)、碱性磷酸二酯酶 (PD) 和无机焦磷酸酶 (IP) 在三种恢复类型中的活性范围：流动沙丘 (MD)、植被恢复沙漠 (RD) 和自然植被 (NV)。PM 和 PD 的测定底物浓度为 25–125 mmol L?1，而 IP 的测定底物浓度为 50–250 mmol L?1。SC, 底物浓度；RT, 恢复类型；ns, 不显著。显著性水平：???p < 0.001; ??p < 0.01; ?p < 0.05。
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无机焦磷酸酶 (IP) 活性随底物浓度增加更为平缓，并在 250 mmol L?1 时达到最高值 (图 3C)。在恢复类型梯度上，IP 活性顺序为 NV > RD > MD，但恢复类型的影响弱于 PM 和 PD 所观察到的影响。方差分析 (ANOVA) 显示底物浓度对所有三种酶均有显著影响 (p < 0.001)，恢复类型对 PM 和 PD 有显著影响 (p < 0.001)，而恢复类型对 IP 的影响不显著 (p > 0.05; 表 1)。这些结果表明，长期植被恢复对 PM 和 PD 活性的增强作用强于 IP 活性。

植被恢复提高了磷酸酶底物亲和力和催化效率
动力学参数进一步区分了三种磷酸酶在恢复类型梯度上的响应 (图 4; 表 2 和 S1)。对于 PM，RD 和 NV 的 Km 和 Km/Vmax 值远低于 MD，表明在测定条件下具有更高的表观底物亲和力和催化效率。尽管 MD 中的 PM Vmax 高于 RD 和 NV，但这伴随着高得多的 Km，导致 MD 的整体催化效率较低。对于 PD，RD 和 NV 的 Vmax 较高且 Km 和 Km/Vmax 较低，表明植被恢复后催化能力和底物亲和力增强。

图 4 三种沙漠恢复类型中磷酸酶动力学的 Lineweaver-Burk 图
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(A) 碱性单磷酸酶 (PM)。
(B) 碱性磷酸二酯酶 (PD)。
(C) 无机焦磷酸酶 (IP)。该图显示了流动沙丘 (MD, 红色方块)、植被恢复沙漠 (RD, 蓝色圆圈) 和自然植被 (NV, 黄色三角形) 土壤中初始反应速率 (1/V?) 与底物浓度 (1/[S]) 之间的双倒数关系。显示了每种恢复类型的线性回归方程和 R2 值。
MD, 流动沙丘；RD, 植被恢复沙漠；NV, 自然植被；PM, 碱性单磷酸酶；PD, 碱性磷酸二酯酶；IP, 无机焦磷酸酶。

# 表2 三种沙漠恢复类型中酶促动力学参数的变化（均值±标准误）

注：本表呈现了三种磷酸酶——碱性磷酸单酯酶（PM）、碱性磷酸二酯酶（PD）和无机焦磷酸酶（IP）——在三种恢复类型——流动沙丘（MD）、人工恢复沙漠（RD）和自然植被（NV）——中的动力学参数（Km/Vmax、Vmax和Km）。Km/Vmax是表观催化效率的倒数指标，值越低表明表观催化效率越高；Vmax表示酶的最大反应速率，值越高表明酶促反应潜力越大；Km代表米氏常数，即在反应速率达到Vmax一半时的底物浓度，Km越低表示底物亲和力越高。统计学显著性：不同大写字母（A、B、C）表示各参数在三种恢复类型之间存在显著差异（p < 0.05）。

**IP的动力学表现出不同的模式。** IP的全部三个动力学参数在MD、RD和NV之间均存在显著差异（p < 0.05；表2）。RD的Km和Km/Vmax低于MD，表明人工恢复后底物亲和力和表观催化效率有所改善。然而，与PM和PD相比，IP在RD与NV之间并未表现出同样的趋同。这些结果表明，长期人工恢复促进了磷酸酶动力学效率的恢复，尤其是PM和PD，而IP的动力学在不同恢复类型中表现出更为独特的模式。

## 磷酸酶特征与土壤磷形态分级相关联

冗余分析显示，磷酸酶特征与土壤P形态之间存在酶特异性关联（图5）。PM和PD活性与有机磷（Or-P）和Ca8-P呈正相关，与Al-P和A-P呈负相关（图5A）。相比之下，IP活性与Ca2-P和A-P的关联更为密切。这些模式表明，不同磷酸酶在恢复类型梯度上与土壤P形态的不同组分相关联。

### 图5 土壤酶促动力学对磷形态变化的影响

**(A) 冗余分析（RDA）：** 该图展示了酶动力学参数（Vmax、Km、Km/Vmax）与不同P形态（如Ca10-P、Fe-P、Al-P、O-P）之间的关系。箭头表示这些关联的方向和强度。

**(B) 变异分割分析（VPA）：** 韦恩图量化了酶动力学对P形态变化的贡献。三组因素解释了67.9%的变异，剩余32.1%未被解释。MKm和MVmax：碱性磷酸单酯酶的Km和Vmax；DKm和DVmax：碱性磷酸二酯酶的Km和Vmax；IKm和IVmax：无机焦磷酸酶的Km和Vmax。

本图展示了三种沙漠土壤环境中酶促动力学与磷形态变化之间的关系。

## 磷酸酶活性的解释力在酶类型间存在差异

PM活性解释了P形态变异的35.4%（p < 0.01），其次是IP活性（31.6%，p < 0.05）和PD活性（28.3%，p < 0.05）（表3）。动力学参数也对P形态变异有显著贡献。对于PM，Km和Vmax与Al-P和A-P相关。对于PD，Vmax与Or-P和Ca8-P高度一致。对于IP，Vmax和Km/Vmax与Ca2-P的关联最为密切（图5B）。单一动力学参数解释了P形态变异的22.3%–25.4%（表3）。

## 表3 酶活性和动力学参数对磷（P）形态的解释力

注：本表展示了不同酶活性及其动力学参数在解释三种沙漠土壤环境中磷（P）形态变异中的解释力（% Explains）、F值和p值。Explains %，各酶参数所解释的P形态变异比例；F，F统计量，表示关系强度；p，统计显著性（p < 0.05表示关系显著）。主要参数：PM，碱性磷酸单酯酶；PD，碱性磷酸二酯酶；IP，无机焦磷酸酶；MKm和MVmax代表碱性磷酸单酯酶的Km和Vmax；DVmax和DKm/Vmax代表碱性磷酸二酯酶的Vmax和Km/Vmax；IVmax和IKm/Vmax代表无机焦磷酸酶的Vmax和Km/Vmax。

**动力学参数** **解释比例%** **F值** **p值**
PM 35.4 5.5 0.002
IP 31.6 4.6 0.01
PD 28.3 3.9 0.026
DKm/Vmax 25.4 3.4 0.022
DVmax 24.5 3.2 0.02
MKm 24.4 3.2 0.026
IKm/Vmax 23.8 3.1 0.036
MVmax 23.1 3 0.022
IVmax 22.3 2.9 0.036

**变异分割分析进一步表明，磷酸酶动力学特征占土壤P形态变异的很大比例（表S2）。** 与PM、PD和IP相关的动力学特征集分别解释了22.9%、32.7%和55.3%的变异，其联合贡献达到67.9%（p < 0.01）。这些结果表明，磷酸酶动力学特征与恢复类型梯度上的P形态组成密切相关。

## 结构方程模型揭示了酶特异性磷恢复途径

采用偏最小二乘结构方程模型评估了磷酸酶活性、动力学特征、酶化学计量比和P形态之间直接或间接关联路径（图6）。在三个酶特异性模型中，磷酸酶活性主要通过涉及动力学特征和化学计量变量的途径影响P形态，而非仅通过直接途径。在PM和PD模型中，连接活性与动力学效率组分的路径为负值，而IP模型中活性与动力学特征之间呈正相关（图6A–6C）。这些相反的路径结构表明，PM、PD和IP通过不同的调控途径对P恢复做出贡献。

### 图6 磷酸酶动力学及其对磷形态影响的PLS-SEM分析

**(A) 碱性磷酸单酯酶（PM）：** 展示了动力学参数（Km、Vmax）和酶活性影响P形态的途径。

**(B) 碱性磷酸二酯酶（PD）：** 突出了酶促动力学和化学计量比对P形态变化的贡献。

**(C) 无机焦磷酸酶（IP）：** 展示了酶促效率与磷形态之间的关系。

本图展示了偏最小二乘结构方程模型（PLS-SEM）结果，显示了三种磷酸酶的酶促动力学与磷形态之间的关系。关键符号：a，酶活性；b，动力学过程；c，酶化学计量比；d，P形态化学计量比；e，P形态。箭头颜色：黑色箭头，正相关；红色箭头，负相关。模型拟合：拟合优度（GOF）值表明解释力较强：PM：0.740；PD：0.780；IP：0.698。

综上所述，这些分析表明，长期人工恢复改变了土壤P形态组成，增强了磷酸酶活性和动力学效率，并加强了酶特征与P周转之间的耦合。研究结果支持了一个酶特异性框架，即PM和PD与有机磷转化更密切地相关，而IP则与干性土壤恢复过程中与钙相关的磷形态更密切地关联。

## 讨论

### 人工恢复促进酶介导的磷恢复

长期人工恢复在恢复类型梯度上重塑了土壤P形态分级和磷酸酶功能。与流动沙丘相比，31年人工恢复站点的总磷、有机磷、有效磷和多种与钙相关的磷形态含量更高，表明植被建立促进了表层土壤中磷的积累和再分配。这一模式与干性生态系统恢复过程中植物输入物的逐渐恢复、地表稳定化、微生物活性增强以及植物-土壤反馈的形成相一致。在流动沙丘中，稀疏的植被和有限的有机质输入限制了微生物的定殖和胞外酶的产生。随着沙丘表面逐渐稳定，在后期演替类型中，凋落物输入、细根周转、根际分泌物以及生物结皮的发育可以为微生物活性和酶介导的营养物质周转创造更有利的小环境。

PM和PD的响应表明，有机磷矿化对人工恢复尤为敏感。这两种酶在人工恢复和自然植被土壤中的活性远高于流动沙丘土壤。其较低的表观Km和Km/Vmax值表明在标准测定条件下具有更高的底物亲和力和催化效率。这些变化表明，人工恢复不仅提高了酶的产量，还改善了酶-底物耦合。在有机质含量低且水分有限的干性土壤中，改善的表观动力学效率对于维持磷供应可能至关重要。PM和PD与Or-P和Ca8-P的密切关联进一步表明，这些酶参与恢复过程中有机磷和中等活性磷库的周转。

然而，经过31年的人工恢复后，土壤P循环的恢复仍不完整。尽管人工恢复站点的总磷和有机磷含量与自然植被下相当，但有效磷、Ca2-P、Ca8-P和Fe-P仍然较低，而Ca10-P较高。这一模式表明，人工恢复土壤中有相当比例的磷仍保留在相对稳定的矿物结合态中。因此，长期人工恢复虽然改善了相对于流动沙丘的土壤磷状况，但并未完全重建自然植被下观察到的磷有效性模式。这种不完全的趋同突显了干旱生态系统营养循环恢复缓慢的特点，并暗示仅靠植被建立可能不足以恢复土壤P周转的所有组成部分。

### IP动力学揭示了一条独特的恢复路径

本研究的一个显著发现是，与PM和PD相比，IP的动力学对人工恢复的响应较弱。这种较弱的响应可能反映了IP独特的底物特异性和生态作用。PM和PD作用于来源于凋落物、根系、微生物残体、核酸和磷脂的广泛磷酸单酯和磷酸二酯化合物。相比之下，IP专门水解无机焦磷酸盐。

这种底物谱的差异很重要，因为焦磷酸盐库可能比PM和PD所靶向的异质性有机磷库更小、更短暂，且受矿物相互作用的调控更强。因此，人工恢复过程中有机质输入的增加可能更直接地刺激PM和PD介导的途径，而非IP介导的焦磷酸盐周转。

微生物功能恢复的差异也可能导致IP响应较弱。PM和PD可由相对广泛的微生物和植物根系产生，而IP相关的过程可能更依赖于参与焦磷酸盐代谢的特定微生物功能。由于本研究未直接测定微生物群落组成和功能基因，因此无法在此确定负责的微生物类群。然而，动力学模式表明，与PM和PD相比，IP相关功能向自然植被状态的趋同程度较低。这与我们的观察一致：人工恢复站点的PM和PD动力学特征更接近自然植被下的水平，而IP则遵循更为独特的恢复轨迹。

在碱性沙漠土壤中，土壤矿物学可能进一步制约IP相关的过程。这些土壤中与钙相关的磷形态丰富，焦磷酸盐可与矿物表面和富含钙的矿物相发生强烈相互作用。这种相互作用可能降低底物的可及性，并削弱标准测定条件下IP动力学的表观响应。因此，IP动力学特征与钙结合态P形态之间的关联应被解释为焦磷酸盐周转与钙结合态P再分配之间耦合的证据，而非对所有钙结合态P池的直接酶促水解。综合来看，底物特异性、微生物功能恢复可能的滞后以及矿物对焦磷酸盐可及性的调控，为IP动力学对人工恢复的响应弱于PM和PD提供了合理解释。

### 磷酸酶动力学作为基于过程的生化恢复指标

在恢复类型梯度上，磷酸酶动力学特征与土壤P形态分级密切相关。变异分割显示，PM、PD和IP的动力学特征共同解释了土壤P形态变异的67.9%，表明酶动力学捕获了与磷再分配相关的生化变异的重要部分。与仅使用酶活性相比，动力学参数提供了关于催化能力、底物亲和力和表观效率的额外信息，已被用于描述磷酸酶介导的P循环的功能潜力。这一区别很重要，因为高酶活性并不一定意味着高效的酶-底物耦合，尤其是在表观Km也较高时。因此，动力学特征有助于区分恢复过程主要是增加了酶的产量、改善了底物亲和力，还是同时促进了这两个过程。

对于恢复评估而言，这些参数最好作为现场标定的、基于过程的指标使用，而非通用阈值。土壤酶长期以来一直作为土壤质量的生物指标使用，因为它们与营养物质循环密切相关，并对土壤管理和生态系统状况的变化做出敏感响应。表观Km、Vmax和Km/Vmax可在标准化测定条件下进行测定，并在不同恢复类型、管理处理和参照生态系统之间进行比较。

本研究中发现，恢复植被土壤在关键动力学性状上向自然植被趋同，反映了一种有利的恢复模式，尤其是单酯酶（PM）和二酯酶（PD）表现出的较低表观Km和Km/Vmax值，同时有效磷、有机磷、土壤有机质和植被覆盖度均有所增加。现阶段不应提出磷酸酶动力学的通用基准值，因为这些参数受土壤类型、pH值、矿物组成、植被、微生物群落和检测方法条件的影响。更为现实的做法是，以自然植被、残留的稳定生态系统或恢复良好的修复点为基础，建立局部或区域参考范围，这与评估半干旱恢复生态系统土壤功能的参考基准方法一致。在此框架下，磷酸酶动力学可以补充传统的化学指标，如有机磷总量和有效磷。化学指标描述磷库的大小，而动力学性状则描述转化和活化这些磷库的生物能力。结合这两类信息，可以更全面地评估旱地修复过程中土壤生物化学的恢复情况。

**对旱地修复的启示**

本研究观察到的酶特异性响应具有旱地修复的意义。PM和PD的恢复表明，当植物输入、微生物活性和地表稳定化增加时，重新植被化可以重建有机磷矿化途径。因此，增强地下碳输入和根际活性的修复策略，如建立豆科植物或深根灌木，可能有利于酶介导的磷转化。然而，无机焦磷酸酶（IP）响应更为受限，表明不同的磷转化途径恢复速度不同。因此，监测计划应考虑多种磷酸酶，而不应仅依赖单一酶指标。

未来的工作应将酶动力学与微生物群落组成、磷循环功能基因及根际过程联系起来。功能标记物如phoD、phoA以及参与焦磷酸代谢的基因，有助于确定表观动力学性状的改变是由微生物群落转变、酶产生还是底物可及性所驱动。根系分泌物和根际特异性酶动力学的测量也将有助于阐明植物性状如何调控磷酸酶的恢复。对不同旱地土壤类型进行重复监测，将有助于建立具有背景特异性的酶动力学指标参考范围，并检验本研究观察到的模式是否可推广至腾格里沙漠以外的地区。

总体而言，本研究表明，长期重新植被化通过酶特异性途径促进了土壤磷的恢复。PM和PD与有机磷矿化密切相关，在酶活性和表观催化效率方面显示出明显的恢复，而IP则遵循更为受限的轨迹，与钙结合磷组分相关联。这些发现表明，重新植被化后的土壤磷恢复并非单一均匀的过程，而是以不同速率恢复的一组互补生物化学途径。因此，磷酸酶动力学性状提供了植被恢复、微生物生物化学功能与土壤磷有效性之间的机制联系，并在以本地参考条件进行校准后，可作为旱地土壤修复的潜在过程型指标。

**研究的局限性**

本研究采用的是修复类型梯度，而非对同一地块的重复时间序列测量。三个样点选在相同区域内，具有大致相似的气候和土壤背景条件，使得该序列适用于比较不同类型沙丘稳定和植被恢复的修复类型。然而，未测量的样点层面差异可能对部分观察到的模式有所贡献。因此，结果应被解释为与修复相关的差异，而非对时间恢复过程的完整重建。对固定样地的长期监测将有助于将方向性恢复与残余空间变异区分开来。

我们的分析聚焦于0–10 cm土层，因为在沙漠土壤中，根际活动、微生物过程、生物结皮发育和磷转化预计在该层最为活跃。这一设计捕获了土壤剖面中最活跃的部分，但深层可能因灌木根系深度、土壤水分再分配和矿物结合磷的储存而表现出不同的磷组分化模式。酶动力学测定亦是在标准化实验室条件下进行的。这些测定有助于比较不同修复类型之间的潜在酶功能，但无法完全代表现场条件下与土壤水分、温度、底物扩散和微生境异质性相关的约束。因此，Km、Vmax和Km/Vmax被解释为测定条件下的表观动力学性状，而非纯化酶的内在常数。

微生物群落组成、磷循环功能基因和根系分泌物谱未被直接测量。这些变量有助于识别观察到的动力学模式背后的生物学驱动因素，尤其是IP相较于PM和PD较弱的响应。未来结合酶动力学、微生物功能标记物、根际采样、垂直土壤剖面和重复野外监测的研究，将有助于更清晰地理解磷酸酶介导的磷恢复在旱地修复过程中如何发展。

**资源可用性**

**主要联系人**

如需进一步信息和资源，请联系主要联系人何明柱（[e-mail]）。

**材料可用性**

本研究未产生新的独特试剂、生物材料或野外材料。

**数据和代码可用性**

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**致谢**

我们衷心感谢科学编辑和两位匿名审稿人提出的建设性意见和建议，这些建议极大地提高了稿件的清晰度和质量。本研究受甘肃省优秀博士项目（编号26JRRA163）、国家自然科学基金（批准号42577551）、中国科学院"西部之光"引进人才培养计划（批准号E5220901）和甘肃省自然科学基金重点项目（编号24JRRA081）资助。

**作者贡献**

M.H. 构思了研究方案，建立了研究框架，设计了实验，监督了项目，解读了结果，并主持了论文的撰写和修改工作。C.X. 参与了实验设计、数据解读和论文修改。C.L. 进行了数据分析，准备了图表，并参与了初稿撰写。H.Q.、J.Z.和S.D. 进行了野外采样、实验室分析和数据收集。所有作者都讨论了结果，审阅了稿件，并批准了最终版本。

**利益声明**

作者声明不存在竞争利益。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 土壤磷组分化和磷酸酶测定的标准分析试剂 | 商业来源 | 标准实验室级别 |
| PM、PD和IP活性测定底物 | 商业来源 | 标准酶测定试剂 |
| CANOCO 5 | Microcomputer Power | CANOCO 5 |
| Origin 2024 | OriginLab | Origin 2024 |
| Adobe Illustrator CS6 | Adobe | Illustrator CS6 |
| SmartPLS 4.1.0.3 | SmartPLS GmbH | SmartPLS 4.1.0.3; https://www.smartpls.com |
| 紫外-可见分光光度计 | 标准实验室仪器 | 用于比色测定 |
| 恒温培养箱 | 标准实验室仪器 | 用于酶培养 |
| 土壤取土钻 | 标准野外仪器 | 用于土芯采集 |
| 2 mm土壤筛 | 标准实验室设备 | 用于土壤样品制备 |

**实验模型和研究参与者细节**

由于本研究未涉及实验模式生物、人类参与者或动物对象，故省略。

**方法细节**

**研究区域**

本研究在中国北方腾格里沙漠东南缘（37°33′N, 105°02′E）的中国科学院西北生态环境资源研究院沙坡头沙漠研究实验站进行。该站海拔1336.4米。该区域具有典型的温带大陆性沙漠气候，冬季寒冷，夏季干燥，多强风，降水季节性强。年平均气温为9.6°C，极端记录范围为?25.1°C至38.1°C。年均降水量为186.2 mm，约80%集中在6月至9月之间。

**修复类型梯度和采样设计**

为评估不同沙漠修复类型下的土壤磷动态和磷酸酶功能，沿修复类型梯度选取了三个代表性样点：流动沙丘（MD）、恢复植被沙漠（RD）和自然植被（NV）（图1）。MD样点由活动沙丘组成，植被稀疏且生物输入极少。RD样点自1992年开始通过长期重新植被化进行稳定，主要种植柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii）和鄂尔多斯锦鸡儿（Artemisia ordosica）。土壤采样于2023年进行，对应约31年的植被恢复期。NV样点以本土植物群落为主，受人类直接干扰极少。

三个样点位于同一沙漠区域，具有大致可比的气候和土壤背景条件。MD样点代表沙丘稳定的早期阶段，RD样点代表长期恢复植被阶段，NV样点则作为具有成熟植被-土壤相互作用的参考条件。该修复类型梯度为比较长期重新植被化与土壤磷组分、磷酸酶活性和酶动力学性状变化之间的关联提供了野外研究框架。

**土壤采样与处理**

土壤样本于2023年6月至9月间采集。在每个样点，建立了三个样地（各3 m × 3 m）。在每个样地内，使用手持取土钻从0–10 cm土层采集五个土芯，充分混合形成一个样地水平的合成样本。在整个修复类型梯度中，共获得九个生物学合成土壤样本，每种修复类型三个生物学重复。

选择0–10 cm土层是因为它代表了沙漠土壤中最生物活跃的部分，根际活动、微生物过程、生物结皮发育和养分转化均集中于此。采集后，样品在冷却容器中运至实验室并分为两个子样。新鲜子样轻轻过2 mm筛以去除根系、石块和粗颗粒碎屑，并在4°C保存以备磷酸酶活性和动力学测定。剩余子样在室温下风干，过2 mm筛网，均质化后用于土壤磷组分化分析。

**土壤磷组分化**

总磷（T-P）通过高氯酸-硫酸消解法测定。有效磷（A-P）使用pH 8.0的0.5 mol L?1 NaHCO?提取。有机磷（Or-P）在550°C灼烧后用0.2 mol L?1 H?SO?提取。无机磷组分采用基于Zhang和Kovar以及Bao的连续提取程序测定。提取的组分包括二钙磷（Ca?-P）、八钙磷（Ca?-P）、磷灰石磷（Ca??-P）、铝结合磷（Al-P）、铁结合磷（Fe-P）和封闭磷（O-P）。

**磷酸酶活性测定**

在4°C保存的新鲜土壤子样用于磷酸酶活性测定。碱性磷酸单酯酶（PM）、碱性磷酸二酯酶（PD）和无机焦磷酸酶（IP）的活性按照已建立的方案测定。测定在酶特异性缓冲条件下进行，PM的pH为11.0，PD和IP的pH为8.0。土壤悬浮液在37°C下与相应底物培养，产物形成通过紫外-可见分光光度计比色法定量。对于PM和PD，在405 nm处测量对硝基酚释放量。对于IP，使用相应比色法测定释放的无机磷酸盐。设置空白以校正非酶水解和背景吸收。酶活性按烘干土壤质量计算，以μmol g?1 h?1表示。所有样品应用相同的测定条件以确保修复类型间的可比性。

**磷酸酶动力学测定**

PM、PD和IP的动力学特征通过底物浓度梯度测定。PM和PD的底物浓度为25、50、75、100和125 mmol L?1，IP的底物浓度为50、100、150、200和250 mmol L?1。在每个底物浓度下计算初始反应速率（V?），并按烘干土壤质量表示。

动力学参数在Michaelis-Menten框架内进行估算：

V? = (Vmax × [S]) / (Km + [S])

其中V?为底物浓度[S]下的初始反应速率，Vmax为最大反应速率，Km为米氏常数。

表观Vmax和Km值使用Lineweaver-Burk双倒数变换估算：

1/V? = (Km/Vmax) × (1/[S]) + 1/Vmax

对于每种酶和每个样品，将1/V?对1/[S]进行回归，从拟合关系的截距和斜率计算出表观Vmax和Km。由于Lineweaver-Burk变换可能不成比例地加权低底物浓度的观测值，由此得到的Km和Vmax值在此解释为标准化测定条件下的表观动力学参数，而非纯化酶的内在常数。这些参数主要用于本研究内不同修复类型之间的比较。Km/Vmax比作为表观催化效率的倒数指标，值越低表明在测定条件下酶-底物偶联效率越高。

**定量与统计分析**

**动力学参数估算**

对于每种酶和每个土壤样品，在相应的底物浓度梯度下计算反应速率。使用Lineweaver-Burk变换估算表观Vmax和Km，并计算Km/Vmax作为表观催化效率的倒数指标。

所有样本均采用相同的底物梯度、孵育条件、空白对照和分析流程，以便在MD、RD和NV土壤之间进行直接比较。实验室测定中的技术重复在统计分析前取平均值，样地水平的复合样本则作为生物学重复处理。
单变量统计分析
在进行参数分析前，先对数据正态性进行评估。采用单因素方差分析（ANOVA）检验三种恢复类型之间土壤P组分和磷酸酶动力学参数的差异，随后进行Tukey's HSD检验。对于跨越底物浓度梯度测定的磷酸酶活性，采用双因素方差分析检验恢复阶段、底物浓度及其交互作用的影响。显著性水平设定为p < 0.05。
多变量分析与结构建模
冗余分析（RDA）用于评估磷酸酶特征与土壤P组分之间的关联。方差分解分析（VPA）用于量化磷酸酶动力学特征组对土壤P组分变异的相对和共同贡献。RDA和VPA使用CANOCO 5软件进行。偏最小二乘结构方程模型（PLS-SEM）用于评估连接磷酸酶活性、酶动力学特征、酶化学计量比和土壤P组分的直接和间接路径。PLS-SEM使用SmartPLS 4.1.0.3软件进行。这些模型用于评估沿恢复类型梯度的酶特异性P恢复途径。
软件
单变量统计分析和图表生成使用Origin 2024软件进行。RDA和VPA使用CANOCO 5软件进行。PLS-SEM使用SmartPLS 4.1.0.3软件进行。最终图表排版使用Adobe Illustrator CS6完成。
补充信息
（1）PDF（129.45 KB）文件S1。表S1和表S2