未成熟嗅觉感觉神经元在完整嗅觉系统中提供补充性感觉输入

《iScience》：Immature olfactory sensory neurons provide complementary input in the intact olfactory system

　　

成体嗅觉感觉神经元（OSNs）的神经发生为理解新神经元如何功能性整合进现有神经环路并参与行为调控提供了独特机遇。既往研究已表明，未成熟OSNs可向小鼠嗅球（OB）中的神经元提供气味输入，且在缺乏成熟OSNs的小鼠中，来自未成熟OSNs的感觉输入足以介导气味检测与辨别。目前尚不清楚的是，在完整嗅觉系统中，未成熟OSNs如何参与气味引导行为。本研究表明，急性化学遗传学沉默未成熟OSNs会损害埋藏食物实验中的表现，其机制可能涉及气味检测能力的改变。此外，急性沉默未成熟OSNs可降低体内嗅球神经元树突中气味诱发的钙信号幅度。综上，这些发现提示未成熟OSNs提供与成熟OSNs输入互补的气味信息，从而在完整嗅觉系统中参与气味引导行为。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

在绝大多数哺乳动物中，神经元在胚胎期或出生后早期即已生成且无法被替换。然而，嗅觉感觉神经元（olfactory sensory neurons, OSNs）是例外：在所有陆生哺乳动物（包括人类）中，OSNs终生由嗅上皮（olfactory epithelium, OE）中的基底干细胞/祖细胞持续产生。嗅上皮中的水平基底细胞（horizontal basal cells, HBCs）是多能干细胞，通常在嗅上皮损伤时被激活进入有丝分裂；球状基底细胞（globose basal cells, GBCs）则持续分裂产生支持细胞和OSNs。GBCs终末分裂产生的神经元定向中间细胞经过一系列发育程序最终分化为成熟OSNs。终末分裂后1–2天，新生OSNs转变为未成熟OSNs，其特征为同时表达GAP43和Gγ8。未成熟OSNs在随后数天内经历渐进性成熟，群体内部存在显著的异质性；终末分裂后7–8天，OSNs下调GAP43和Gγ8表达，同时上调嗅觉标记蛋白（olfactory marker protein, OMP）。

在小鼠中，成熟OSNs通常表达约1100种气味受体（odorant receptor, OR）基因中的一种，表达相同OR的成熟OSN轴突汇聚到嗅球（olfactory bulb, OB）中相同的肾小球，与OB神经元形成突触连接，从而构建高度有序的气味输入图谱。由于既有OSNs持续凋亡而新生OSNs同步生成，这种持续更替创造了一个高度可塑的环境，新生OSNs必须整合进既有环路才能参与嗅觉功能。因此，理解持续进行的OSN神经发生如何影响气味加工、可塑性和气味引导行为具有重要意义。

长期以来，人们假定成熟OSNs是OB气味输入的唯一来源。然而，越来越多的证据表明未成熟OSNs也参与嗅觉功能。OSNs在终末分裂后4天即开始表达ORs，远早于OMP表达的开始；未成熟OSNs强烈上调神经突生长相关基因，开始将轴突投射至OB肾小球并形成带有短纤毛的树突小结。更重要的是，未成熟OSNs能够检测气味分子并与OB投射神经元形成突触连接。未成熟与成熟OSNs的气味选择性相似，但未成熟OSNs的气味检测阈值更高，且在成熟OSN反应已饱和的高浓度气味条件下仍能继续编码浓度信息。此外，在甲巯咪唑介导的OSN消融后仅5–7天的早期恢复时间点，未成熟OSNs的感觉输入足以介导气味检测与辨别。这些数据共同表明未成熟OSNs向嗅觉系统提供了具有行为相关性的信息。

然而，在完整嗅觉系统中未成熟OSNs究竟发挥何种贡献仍属未知。研究人员假设未成熟与成熟OSNs向OB神经元提供互补的气味输入，并据此开展本研究，旨在回答两个关键问题：第一，在正常生理条件下未成熟OSNs是否参与气味引导行为；第二，在完整嗅觉系统中未成熟OSNs是否对OB神经元的气味诱发反应有所贡献。

二、主要关键技术方法

研究人员采用基于DREADD（由设计药物 exclusively activated by designer drugs）的化学遗传学策略，构建Gγ8-tTA;tetO-hM4Di（简称Gγ8-hM4Di）转基因小鼠品系，利用Gγ8启动子仅在未成熟OSNs中表达的特性，驱动抑制性hM4Di受体在约60%未成熟OSNs中的选择性表达，通过腹腔注射CNO（clozapine-N-oxide）实现急性选择性沉默。以tetO-hM4Di小鼠（因缺乏tTA驱动子而不表达hM4Di）作为阴性对照。研究采用的行为学范式包括埋藏食物实验和气味习惯化-去习惯化实验。在体神经活动记录方面，研究人员在出生后第2天（P2）向小鼠右侧OB注射AAV5-syn-GCaMP6s，于P24–P35期间植入急性颅窗，采用双光子钙成像记录OB肾小球层气味诱发反应。此外还通过磷酸化S6（PS6）即刻早期基因免疫组化染色评估OB僧帽细胞（mitral cells, MCs）活性。实验小鼠共59只，按基因型和处理条件分为不同队列：行为学测试使用6–8周龄小鼠，钙成像使用P24–P35小鼠，免疫组化使用6–8周龄小鼠，各组男女比例大致均衡。

三、研究结果

1. hM4Di的选择性表达可沉默约60%的未成熟OSNs

研究人员通过GAP43（未成熟OSN标记）与hM4Di受体上的血凝素（HA）标签共免疫染色验证了hM4Di在未成熟OSNs中的特异性表达。结果显示Gγ8-hM4Di小鼠中约60%的未成熟OSNs表达hM4Di受体，而tetO-hM4Di对照小鼠不表达hM4Di。为验证沉默效果，研究人员在1小时气味暴露后对OB进行PS6免疫染色，发现CNO处理显著降低了Gγ8-hM4Di小鼠僧帽细胞层（MCL）中PS6阳性细胞的线性密度，且背侧和腹侧OB区域均观察到显著降低；而tetO-hM4Di对照小鼠中CNO处理无此效应。这验证了该策略可在整个OB范围内急性、选择性地沉默未成熟OSN输入。

2. 沉默未成熟OSNs降低OB僧帽细胞对气味的反应活性

在1小时气味暴露后，通过PS6即刻早期基因染色评估僧帽细胞活性。结果显示，与生理盐水处理的Gγ8-hM4Di小鼠相比，CNO处理显著降低了MCL中PS6阳性细胞密度，表明未成熟OSN沉默导致僧帽细胞活性降低。将MCL细分为背侧和腹侧区域后，未成熟OSN沉默在两个区域均产生显著效应。该效应在tetO-hM4Di对照小鼠中不存在，进一步验证了策略的特异性。

3. 未成熟OSN沉默损害埋藏食物实验表现

埋藏食物实验用于测试气味检测能力。在Gγ8-hM4Di小鼠中，所有生理盐水处理的小鼠均在10分钟内成功找到并挖出埋藏的食物，而8只CNO处理的小鼠中有2只未能在限定时间内完成任务。CNO处理的Gγ8-hM4Di小鼠找到埋藏食物的时间显著长于生理盐水处理组。tetO-hM4Di对照小鼠中CNO处理无显著效应。各实验组在5分钟适应期内的挖掘时间无差异，表明CNO处理未影响运动功能；所有小鼠在实验完成后均进食，表明各组动机水平相似。这些数据表明沉默未成熟OSNs损害了埋藏食物实验表现，提示未成熟OSNs可能在正常生理条件下参与气味检测。

4. 未成熟OSN沉默可能不影响习惯化-去习惯化任务表现

气味习惯化-去习惯化实验用于测试气味辨别能力。结果显示各实验组在探究时间上无显著差异。在习惯化指数方面，Gγ8-hM4Di和tetO-hM4Di小鼠中CNO处理均无显著效应；在去习惯化指数方面，各实验组间无显著差异。然而，研究人员注意到部分实验组未表现出显著的习惯化或去习惯化证据：仅生理盐水和CNO处理的Gγ8-hM4Di小鼠表现出显著习惯化，仅CNO处理的Gγ8-hM4Di小鼠表现出显著去习惯化。因此，部分实验组在该实验中的表现不符合预期，无法就未成熟OSN沉默对气味辨别的影响得出强有力结论。

5. 未成熟OSN沉默降低OB神经元树突气味诱发反应幅度

研究人员通过新生期AAV5-syn-GCaMP6s注射和急性颅窗植入，在体记录了OB肾小球层（GL）的气味诱发钙反应。GCaMP6s表达在MCL中最为突出，僧帽细胞和簇状细胞（tufted cells, TCs）的顶树突投射至GL，因此记录的GL钙反应主要反映MC和TC树突反应。在7种气味分子组成的刺激面板下，CNO处理后Gγ8-hM4Di小鼠的平均气味诱发反应幅度显著降低。对单个肾小球的分析显示，77%的肾小球-气味配对表现出反应幅度降低，23%表现出增加；增加通常幅度较小，且约一半在CNO处理前无反应。有趣的是，CNO处理前反应幅度较大的肾小球-气味配对在CNO处理后表现出更大的幅度降低。气味选择性方面，以寿命稀疏度（lifetime sparseness, S_L）衡量，CNO处理未显著改变Gγ8-hM4Di小鼠的S_L值。tetO-hM4Di对照小鼠中CNO处理对反应幅度和选择性均无影响。

四、讨论与结论

研究人员估算，Gγ8+ OSNs约占未成熟和成熟OSN总群体的29%，考虑到只有终末分裂后5–8天的Gγ8+ OSNs能向OB提供感觉输入，CNO处理最多沉默约17%的总OSN输入。鉴于OSN输入在OB中高度汇聚，沉默如此小比例的输入即产生显著行为学和生理学效应，提示未成熟OSN输入可能不同于成熟OSN输入。此前研究发现未成熟OSNs在成熟OSN反应已饱和的高浓度范围内仍编码气味浓度信息，这为理解其功能提供了可能解释：当小鼠接近气味源时，成熟OSN反应可能饱和，而未成熟OSNs在最终气味源定位中发挥重要作用。在这一模型中，成熟OSN输入在远离埋藏食物时发挥重要作用，而未成熟OSN输入对于精确定位埋藏食物至关重要。

关于气味习惯化-去习惯化数据，由于部分实验组未表现出预期的习惯化或去习惯化行为，无法得出强有力结论。可能的影响因素包括小鼠年龄较轻以及使用装有气味滤纸的茶球而非气味棉签等。

关于钙成像中少数肾小球反应幅度增加的现象，研究人员提出了几种可能的非互斥解释：减少的传入输入可能同时降低了对所成像MC和TC的侧向抑制；或由于兴奋性输入减少而缓解了GABA_B和/或多巴胺D2受体介导的OSN突触前末梢抑制。此外，建模研究提示OSN轴突间可能存在电突触传递，但尚无实验证据支持哺乳动物OSN轴突间存在电突触传递。

未成熟OSN沉默不影响气味选择性，这与既往研究中未成熟与成熟OSN轴突气味选择性相似的发现一致。针对单细胞RNA测序发现部分未成熟OSNs表达多种OR转录本的现象，近期研究揭示了一种Mex3a依赖的转录后调控机制可抑制未成熟OSNs中多种OR的翻译，从而解释了这一差异。

本研究的主要局限性包括：双光子钙成像仅限于光学可及的背侧OB肾小球；成像期间小鼠使用右美托咪定镇静，其镇静深度在约90分钟的成像过程中可能逐渐降低；hM4Di仅表达于约60%的未成熟OSNs；未从未成熟OSNs的在体记录中获得CNO介导沉默的直接证据，OB神经元活性读数仅提供间接估计。

综上所述，本研究证明急性化学遗传学沉默未成熟OSNs会损害埋藏食物实验表现，降低OB僧帽细胞中即刻早期基因标记的神经元活性，并在不影响气味选择性的情况下降低多个肾小球中气味诱发反应的整体幅度。这些数据表明，在完整嗅觉系统中，未成熟OSNs提供与成熟OSNs互补的气味输入，参与气味加工和气味引导行为。这一发现挑战了新生OSNs必须达到成熟才能功能性整合进嗅觉环路的传统观点，凸显了出生后持续产生的OSNs在发育过程中即对正常气味加工做出重要贡献。