《SCIENCE ADVANCES》：TRAF7 mutations stabilize K/NRAS and hyperactivate MAPK signaling to cause CAFDADD neurodevelopmental defects
编辑推荐：
MAPK-ERK1/2通路在胚胎发生过程中的神经发育中起着至关重要的作用，该信号级联的过度激活是多种神经发育障碍的病理学标志。编码RING型E3泛素连接酶的TRAF7基因种系变异与心脏、面部和数字异常伴发育迟缓（CAFDADD）综合征存在遗传关联；然而，TRA
MAPK-ERK1/2通路在胚胎发生过程中的神经发育中起着至关重要的作用，该信号级联的过度激活是多种神经发育障碍的病理学标志。编码RING型E3泛素连接酶的TRAF7基因种系变异与心脏、面部和数字异常伴发育迟缓（CAFDADD）综合征存在遗传关联；然而，TRAF7的下游底物以及驱动神经发育缺陷的确切机制仍不清楚。在此，研究人员建立了一种Traf7R654Q/+敲入小鼠模型，以及携带复发性TRAF7R655Q突变的患者特异性诱导多能干细胞（iPSC）来源的人皮层类器官（hCOs）。杂合Traf7R654Q/+小鼠表现出显著的生长迟缓、骨骼异常和神经行为缺陷，而突变型hCOs则显示出早期皮层神经发生缺陷，其特征为过早的神经分化和祖细胞池耗竭。机制上，生化分析揭示TRAF7与KRAS和NRAS相互作用，促进其多聚泛素化及随后的蛋白酶体降解，从而对下游MAPK级联维持生理性稳态控制。CAFDADD相关的TRAF7变异发挥显性负效应，破坏野生型（WT）蛋白功能，并导致KRAS和NRAS的翻译后积累，从根本上驱动组成性MAPK-ERK1/2通路过度激活。值得注意的是，使用selumetinib对MEK1/2进行药理学抑制可抑制ERK1/2过度激活，部分缓解TRAF7R655Q/+ hCOs中异常的神经上皮形态和神经分化，并改善Traf7R654Q/+小鼠的脑/体重比。总之，研究人员的发现将TRAF7确定为发育过程中RAS蛋白稳态的关键翻译后调节因子，并揭示了RAS泛素化受损与CAFDADD发病机制之间的关键机制联系，为靶向MAPK通路以应对TRAF7相关疾病中持续存在的发育缺陷提供了初步的临床前沿证据。
心脏、面部和数字异常伴发育迟缓（CAFDADD）综合征是一种由TRAF7基因杂合错义突变引起的先天性发育障碍，患者常表现出颅面畸形、骨骼与心脏异常、智力障碍及自闭症样行为。TRAF7编码RING型E3泛素连接酶，但其致病底物和下游机制此前仍不清楚，临床上也缺乏针对性治疗。为阐明这一疾病机制，研究人员构建了携带患者等效突变Traf7R654Q的敲入小鼠模型，并利用来自一名中国女性CAFDADD患者及其健康父亲的诱导多能干细胞（iPSC）分化出人皮层类器官（hCOs），同时通过CRISPR-Cas9基因编辑制备同源校正对照系。研究表明，TRAF7通过其WD40重复结构域与KRAS和NRAS直接结合，促进这两种RAS蛋白的多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而维持下游MAPK-ERK1/2通路的稳态。CAFDADD相关TRAF7突变体因结合能力下降而丧失这一功能，并以显性负效应干扰野生型TRAF7，导致K/NRAS蛋白稳定积累，使MAPK-ERK1/2通路被组成性过度激活。使用MEK1/2抑制剂selumetinib可部分逆转这些异常，提示该通路是潜在治疗靶点。相关成果发表在《SCIENCE ADVANCES》。
研究人员主要使用了以下关键技术：采用胚胎干细胞（ES）靶向技术制备Traf7R654Q/+敲入小鼠；将患者及其健康父亲来源的iPSC定向分化为hCOs，并利用CRISPR-Cas9构建同源校正系；通过免疫共沉淀和体内泛素化实验检测TRAF7与K/NRAS的互作及降解调控；运用Western blot、免疫染色、转录组测序分析信号通路变化；结合行为学测试、结构磁共振成像（sMRI）和多电极阵列（MEA）评估神经功能；最后用selumetinib进行药理学干预验证靶向效应。
杂合Traf7R654Q/+ KI小鼠表现出显著的生长迟缓和多器官异常：通过ES细胞靶向技术构建小鼠模型，研究发现纯合突变导致胚胎致死，杂合小鼠从出生后即出现生长迟缓，颅骨长度和宽度减小，心肌发育不良导致心功能下降，并伴有肢体和迟发性眼部异常，表明该模型可部分模拟患者的多系统表型。
Traf7R654Q/+小鼠表现出社交缺陷、认知障碍和运动异常：通过三箱社交实验、直接社交互动测试、Barnes迷宫、旷场实验和高架十字迷宫等行为学检测，发现突变小鼠社交识别记忆受损、空间学习记忆下降、自发活动减少，但无焦虑样行为；sMRI显示皮质、海马、小脑等多个脑区灰质体积改变，与行为异常相符。
Traf7R654Q/+小鼠中MAPK-ERK1/2通路过度激活：Western blot和免疫组化检测显示，突变小鼠脑和心脏组织中磷酸化MEK1/2和ERK1/2水平显著升高，KRAS和NRAS蛋白水平上升但mRNA水平不变，提示存在翻译后调控异常，而HRAS和RRAS无变化。
CAFDADD相关TRAF7突变体在促进K/NRAS泛素化和降解方面存在缺陷：通过内外源免疫共沉淀实验确认TRAF7经WDR结构域与K/NRAS结合；来自患者的多种错义突变体（如K346E、L402V、R524W、T601A、R655Q）均表现出与K/NRAS结合减弱，丧失促进其降解的能力，并通过对野生型蛋白的显性负效应导致K/NRAS稳定；体内泛素化实验证实突变体几乎完全消除K/NRAS的多聚泛素化。
患者来源的TRAF7R655Q/+ hCOs表现出早期皮层缺陷：与对照组和同源校正组相比，突变类器官在培养19天后体积显著减小，神经祖细胞（SOX2+、PAX6+）增殖减少而凋亡未增加；TBR2+中间祖细胞比例增加，提示神经分化提前发生；培养至70天时皮层深层和浅层投射神经元标志物（TBR1、CTIP2、SATB2）减少，NEUN+成熟神经元比例下降，多电极阵列记录到放电率和网络同步爆发减弱，表明神经成熟和网络功能受损。
患者来源的TRAF7R655Q/+ hCOs中MAPK-ERK1/2信号组成性激活：Western blot和免疫染色证实，突变iPSC和hCO中KRAS、NRAS蛋白水平以及磷酸化MEK1/2、ERK1/2水平均显著高于对照，与小鼠模型结果一致。
Selumetinib可显著缓解TRAF7R655Q/+ hCOs和Traf7R654Q/+小鼠的神经发育相关异常：转录组测序显示突变hCO中RAS/MAPK、钙信号和GABA能突触等神经发育相关通路基因表达异常；selumetinib处理后，ERK1/2磷酸化受到抑制，部分异常表达基因得到恢复，类器官尺寸增大，异常增多的TBR2+细胞减少，且未引起明显细胞毒性；在Traf7R654Q/+小鼠体内，selumetinib可部分改善脑/体重比并降低皮层ERK1/2磷酸化。
讨论部分指出，TRAF7突变导致的RAS泛素化降解障碍是MAPK通路过度激活的核心机制，该机制使CAFDADD在分子层面与RASopathies相关，但在临床表型和肿瘤风险上存在差异。小鼠模型未能完全重现患者的心脏表型，提示物种特异性和遗传修饰因子的影响。同时，TRAF7还可能通过CDC42、RAC1等底物发挥作用，因此单纯靶向MAPK通路可能无法全面逆转已形成的结构缺陷。研究结论认为，TRAF7是发育过程中RAS蛋白稳态的关键翻译后调节因子，受损的RAS泛素化与CAFDADD发病直接相关，为临床前阶段靶向MAPK通路管理TRAF7相关发育缺陷提供了初步依据。
