视网膜基因表达向细胞类别映射：揭示视网膜昼夜节律的细胞基础

《Clocks & Sleep》：Mapping Retinal Gene Expression to Cell Classes: Insights into Retinal Circadian Rhythms

　　

摘要专业翻译 许多视网膜过程受昼夜节律调控。既往研究已鉴定出在24小时周期内呈现节律性视网膜表达的基因，但这些基因中许多的细胞类别特异性仍属未知。本研究提出一个基于现有的人视网膜单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、并利用已知视网膜标志物进行验证的数学模型，该模型可将基因分配至其呈现独特富集表达的细胞类别。该模型为超过10,000个人类基因赋予了视网膜细胞类别特异性，并为视网膜细胞标志物提供了潜在的新候选基因。此外，该模型还使转录组数据集能够通过细胞类别富集分析进行研究。研究人员将该模型应用于已发表的小鼠眼部转录组数据中的昼夜节律表达基因。超过35%的这些基因被分配至特定细胞类别，其中许多基因此前几乎没有文献报道其视网膜定位及功能。该研究还证明了光感受器相关转录本存在显著富集，其中许多与光转导和外节更新相关。本研究提供的方法和数据为关注视网膜基因细胞类别特异性表达的研究人员提供了资源，并为视网膜昼夜节律的细胞基础提供了新见解。

论文解读

一、研究背景与研究意义

视网膜作为感知光线并将时空光强变化转化为视觉信号的神经组织，在24小时周期内经历剧烈的功能变化以适应全天光照水平的变化。视网膜还向视交叉上核传递信息，使机体内部昼夜节律与外部光/暗周期同步，从而调节休息/活动模式以及瞳孔收缩、褪黑素和皮质醇合成、睡眠、认知和情绪等广泛的非视觉光反应。视网膜含有依赖于转录-翻译反馈环路的自主分子时钟，核心时钟蛋白CLOCK和BMAL1形成异二聚体转录因子，与E-Box元件相互作用上调PER1、PER2、CRY1和CRY2的转录，产生的PER和CRY蛋白二聚化并抑制BMAL1/CLOCK活性；辅助环路中BMAL1/CLOCK激活RORα和REV-ERBα的转录，分别促进或抑制BMAL1转录，驱动其活性的节律性。许多视网膜过程直接或间接受该反馈环路调控，包括多巴胺和褪黑素合成、光感受器外节盘脱落、视网膜电图反应和光感受器耦合等。

昼夜节律基因表达可通过全组织方法如微阵列或批量RNA测序（RNA-seq）分析，也可通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对单个细胞进行测序。尽管scRNA-seq允许在单细胞水平定位基因表达，但利用scRNA-seq数据跨多个时间点比较视网膜转录组存在技术挑战。相反，批量视网膜RNA测序虽然在不同时间点更便宜和方便，但无法报告细胞类别特异性。解决这一问题的一种方法是使用全组织方法鉴定节律基因，然后利用统计技术从批量RNA-seq表达数据中数学分离预测的单个细胞类别表达谱，即反卷积方法。然而，这些方法在视网膜中可能不适用，因为星形胶质细胞、小胶质细胞、视网膜神经节细胞（RGCs）和水平细胞各占视网膜细胞的比例不超过1%，低于大多数方法的最低比例阈值。此外，统计反卷积通常需要准确了解细胞类别比例，而历史数据集很少具备这一条件。因此，现有统计反卷积方法在分析现有视网膜批量RNA-seq数据集时往往不可行。由于不同视网膜细胞类别具有与其他组织相比显著特异且特征明确的功能，基因表达的细胞类别定位往往是理解视网膜转录组研究结果的关键步骤。研究人员在此开发、验证并应用一个简约模型来为视网膜中的基因分配特定细胞类别。

二、研究内容与主要结论

研究人员使用已发表的人类视网膜scRNA-seq数据，将细胞聚类为十个不同类别：视杆细胞、视锥细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、RGCs、小胶质细胞、星形胶质细胞、Müller细胞和"其他"类别。该模型在某个细胞类别中的表达满足表达水平和表达特异性的标准值时，将该基因的表达报告为该细胞类别特异性。为验证该方法，研究人员使用了从文献中鉴定的81个已知在哺乳动物物种视网膜中具有细胞类别特异性的基因数据集。该模型不仅分配细胞类别，还能在任意基因列表中确定富集于视网膜细胞类别的基因。研究人员将该方法应用于已发表的视网膜昼夜节律数据，该数据包含通过批量RNA-seq鉴定的206个节律性视网膜转录本，其中84个被赋予细胞类别特异性。这些数据为视网膜昼夜节律的细胞基础提供了新见解，突出了大量受昼夜节律控制的光感受器特异性转录本。

三、关键技术与方法

研究人员基于Lukowski等人2019年发表的人类视网膜scRNA-seq数据构建模型，该数据涵盖23,000个细胞、每细胞40,232个读段的测序深度，覆盖21,989个人类基因。通过文献检索鉴定出83个经实验验证的视网膜细胞类别特异性标志基因，排除2个在源数据集中无检测表达的基因后，以81个标志基因进行模型验证。模型采用双参数标准：富集参数定义为单个细胞类别中必须包含的总视网膜表达的最低百分比，特异性参数定义为该细胞类别中允许在另一细胞类别中出现的表达水平最大百分比。通过系统扫描确定最优参数为富集30%、特异性65%。此外增设"光感受器"类别，以识别在视杆和视锥细胞中均高表达的基因，该类别参数为富集25%、特异性55%。基因同源性数据来自小鼠基因组信息学（MGI），仅纳入具有1:1人类-小鼠直系同源关系的基因。视网膜疾病相关基因来自RetNet数据库。

四、主要研究结果

4.1 文献调查

研究人员基于已发表文献鉴定了83个被报道在体内对单一视网膜细胞类别具有特异性的基因，其中2个因源数据集中无可检测表达而被排除，最终使用81个具有跨哺乳动物物种视网膜细胞类别特异性表达强证据的基因。标志物覆盖视杆细胞（14个）、视锥细胞（12个）、水平细胞（4个）、双极细胞（14个）、无长链细胞（8个）、RGCs（11个）、Müller细胞（6个）、星形胶质细胞（4个）和小胶质细胞（8个）。

4.2 未分配聚类特征分析

源数据中"其他"类别包含两个聚类（C5和C14）。分析显示C5中视杆和Müller细胞标志物表达增加，C14中视杆和视锥标志物表达增加。该类别对RPE标志物呈中等但不一致的表达，且无血管内皮标志物CD31和CD146的显著表达。该类别最可能代表来自视杆、视锥及可能的Müller细胞和RPE的混合碎片，因此被排除在进一步分析之外。

4.3 视网膜细胞标志物

基于总视网膜表达百分比，从文献中鉴定的细胞类别特异性标志物在预期细胞类别中高度表达。无长链细胞标志物和RGC标志物观察到一定变异性。

4.4 模型开发与验证

通过双参数模型，确定富集参数30%和特异性参数65%为最优。在此参数下，81个标志基因中的72个（89%）被正确报告为细胞类别特异性。9个失败的标志物中，6个在与其报道标志物不同的细胞类别中表达最高，3个因在第二细胞类别中也显示高表达而在特异性参数上失败。将该模型应用于源数据集中21,989个人类基因，10,748个被分配到特定视网膜细胞类别；仅考虑14,596个具有1:1人类-小鼠直系同源的基因，6,007个小鼠基因被分配到特定视网膜细胞类别。

4.5 增设"光感受器"类别

为识别在视杆和视锥细胞中均高表达的基因，增设"光感受器"类别。参数设定为富集25%、特异性55%。在此参数下，210个人类基因和126个具有1:1人类直系同源的小鼠基因被分配到该类别。

4.6 应用于视网膜昼夜节律数据

将模型应用于持续黑暗（DD）条件下小鼠眼部的节律基因。在234个独特节律基因中，21个无1:1人类直系同源，7个人类直系同源在源scRNA-seq数据集中不表达，最终206个基因中84个（40.8%）被分配特定细胞类别。细胞类别富集分析发现视杆、视锥和光感受器在这些基因中显著富集。

4.7 应用于视网膜日节律数据

将模型应用于日间条件（LD）下小鼠眼的节律基因。832个基因中，93个无1:1人类直系同源，16个人类直系同源在源数据集中不表达，最终723个基因中271个（37.5%）被分配特定细胞类别。同样发现视杆、视锥和光感受器显著富集。LD和DD数据集中视杆、视锥和光感受器特异性基因呈现近乎完全重叠。

4.8 疾病相关性

将细胞类别特异性节律基因与RetNet数据库中348个导致单基因视网膜病变的人类基因进行查询比对。DD条件下14个（16.7%）和LD条件下32个（11.8%）细胞类别特异性昼夜节律基因与视网膜病变相关，其中DD和LD条件下超过30%的视杆和光感受器特异性昼夜节律基因以及LD条件下超过20%的视锥特异性昼夜节律基因与视网膜病变相关。

四、讨论与结论

研究结果表明光感受器在视网膜昼夜节律转录组变化中占很大比例，这些光感受器昼夜节律变化可能构成光感受器对昼夜周期光照变化预期的基础，包括视杆特异性（Sag、Pde6b、Pde6g、Rcvrn）、视锥特异性（Arr3、Guca1b）和光感受器特异性（Guca1a）光转导成分。许多节律性视杆、视锥和光感受器富集基因在外节脱落、更新和运输中具有已确认或潜在作用，与先前报道的小鼠视网膜日间峰值昼夜节律转录本中纤毛组装相关基因富集一致。其他细胞类别特异性基因直接参与核心昼夜节律机制以及视网膜多巴胺和褪黑素的节律性，如视杆富集的Usp2和Hsp90aa1参与BMAL1稳定性调节，视锥富集的Adcy1通过D4受体介导多巴胺作用产生光感受器cAMP夜间峰值，刺激AANAT活性促进昼夜节律性褪黑素分泌。

研究存在若干局限性：模型基于人类scRNA-seq数据转换到小鼠昼夜节律数据，人类和小鼠视网膜存在重要差异；转录本水平的节律性不能保证蛋白功能的节律性；源scRNA-seq数据可能代表日间或基线状态，可能遗漏夜间峰值的高振幅昼夜节律转录本；小鼠为夜行性而人类主要为昼行性，时间生态位差异可能影响结果向人类视网膜的转化解读；源数据仅来自3个个体，年龄42至80岁；模型未研究细胞类别内已知亚群如RGC亚群、S视锥和L/M视锥、ON和OFF双极细胞的富集。

总之，该研究提出一个用于将视网膜基因映射到特定细胞类别并计算视网膜基因数据集中细胞类别富集的简约模型，将其应用于已发表的视网膜昼夜节律数据，证明了光感受器相关转录本的富集。该工作为独立鉴定和验证关键昼夜节律转录本和蛋白质在视网膜内在节律性功能中的作用提供了有用的起点，特别是那些此前视网膜细胞类别特异性未知的基因。