《International Journal of Biological Macromolecules》：Mutagenesis-guided modeling of the Lynx1–α7 nicotinic acetylcholine receptor complex: An iterative feedback-driven approach
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•Lynx1与α7-nAChR的静息态相互作用，且不影响脱敏过程。•基于突变引导的集成对接方法构建了Lynx1–α7-nAChR复合物模型。•评分函数能够解释功能缺失突变、功能获得突变和中立突变。•GPI锚定糖链核心参与α7-nAChR–Lynx1复合物的形成。•Lynx1环
• Lynx1与α7-nAChR的静息态相互作用，且不影响脱敏过程。
• 基于突变引导的集成对接方法构建了Lynx1–α7 -nAChR复合物模型。
• 评分函数能够解释功能缺失突变、功能获得突变和中立突变。
• GPI锚定糖链核心参与α7-nAChR–Lynx1复合物的形成。
• Lynx1环II和GPI锚定域与ECD–TMD区域相互作用，阻断受体激活。
引言 α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7-nAChR）是一种同五聚体配体门控阳离子通道，具有高Ca2+ 通透性[1], [2]，是阿尔茨海默病、精神分裂症、炎症性疾病和癌症的公认治疗靶点[3], [4], [5], [6]。在nAChR功能的内源性调节因子中，Ly6/uPAR超家族的三指蛋白或三环蛋白发挥着突出而多样的作用[7], [8]。Lynx1是该家族中一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的三指蛋白，与α7-nAChR在学习和记忆相关的脑区中共定位[9]。Lynx1通过降低激动剂敏感性、加速脱敏和减慢脱敏恢复来调节α4β2-nAChR的功能[10]。Lynx1基因敲除延长了视觉皮层中经验依赖性可塑性超过关键期的持续时间，确立了Lynx1作为胆碱能可塑性"分子刹车"的地位[11]。缺乏GPI锚定域的Lynx1重组水溶性结构域（ws-Lynx1）一直是Lynx1–α7-nAChR相互作用结构-功能研究的主要工具[12], [13], [14]。鼻内滴注ws-Lynx1可改善体内与α7-nAChR功能障碍相关的认知衰退[15], [16]。这表明Lynx1是有望成为促认知药物的原型。
为了理性设计新的基于Lynx1的生物医学药物，了解α7-nAChR与神经调节因子的复合物结构是必要的。尽管近年来α7-nAChR的结构生物学取得了重大进展，已有其在apo（静息）、激活和脱敏状态下的高分辨率冷冻电镜结构，以及其与各种调节分子复合物的结构[17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24]，其跨膜和胞内结构域的NMR/EPR表征[25], [26], [27]，以及门控景观的分子动力学和马尔可夫状态建模[28], [29]，但至今仍未解析到α7-nAChR与Lynx1的复合物实验结构。这可能是由于Lynx1与受体结合的亲和力相对较低且具有可逆性，或者需要"脂筏"型膜环境来稳定复合物。在Lynx1–α7-nAChR复合物的实验结构可用之前，整合计算建模是一种生成结构模型以开发新型基于Lynx1的调节剂的实用方法。
早期根据ws-Lynx1的NMR结构和同源建模的受体胞外结构域构建的Lynx1–α7-nAChR模型提出了初步的结合界面[12], [13]，但这些模型是在高分辨率膜嵌入α7-nAChR结构可用之前构建的。此外，这些模型仅基于ws-Lynx1的突变数据，且未采用系统性对接。最详细的计算研究由Dong等人完成，他们模拟了全长GPI锚定Lynx1与膜嵌入的(α4 )3 (β2 )2 nAChR的复合物[30]。然而，初始结合姿态是通过受α-金环蛇毒素结合模式指导的手动放置生成的，而非通过穷举对接；关键的分子间接触通过100 ns平衡阶段中的3 ?距离约束来强制施加；使用的是α4 β2 亚型受体而非α7；并且仅在一个α4 –α4 界面处放置了一个Lynx1分子。所提出的C环调节机制虽然合理，但仍然是完全基于计算的假说，缺乏实验支持。
本文提出了一个迭代方法来建模Lynx1–α7-nAChR复合物，该方法结合了神经调节因子和受体的双向丙氨酸扫描突变、针对受体静息态和脱敏态的穷举集成对接[31]，以及基于突变数据的定量对接解评分。结合GPI锚定几何约束，所提出的评分函数将初始338,000个对接姿态大幅减少至仅7个解。经无约束分子动力学精炼的最终Lynx1–α7-nAChR模型考虑了Lynx1的GPI锚定域、受体的N-糖基化、膜邻近性以及五个结合位点间的变异性。所得模型为解读突变数据提供了结构框架，并发现了GPI锚定糖链核心对与受体结合的非预期贡献。Lynx1环II和GPI锚定域与α7-nAChR的ECD–TMD偶联区域形成稳定接触，可能阻止受体激活。所提出的机制为新型促认知药物的理性设计开辟了新视角。
分节摘要 重组蛋白制备 ws-Lynx1及其位点替换突变体D11A、R37A、D54A（图S1）通过大肠杆菌中的重组表达获得，如文献[32]所述。通过HPLC、一维1 H NMR光谱和MALDI-MS验证了蛋白质的均一性、纯度（>95%）、正确折叠以及所需替换的成功引入（图S1）。
本文中的残基编号均遵循成熟多肽序列。对于α7-nAChR（UniProt:
P36544 ），编号从成熟链的G1开始（在
结果 本研究围绕一种迭代的、反馈驱动的优化策略展开（图1），其中探索性对接解受到实验突变数据的检验，并在此基础上进行精炼。由于结果部分的目标是呈现最终的与实验一致的结合模式，而非按时间顺序重建中间模型的完整序列，以下各节围绕最终经突变精炼的模型以及
本迭代方法与先前Lynx1–nAChR模型的比较 早期模型将ws-Lynx1的NMR结构放置在同源建模的α7-nAChR胞外结构域（ECD）的亚基间裂隙处，并基于ws-Lynx1突变体在嵌合受体上的活性进行判断，该嵌合受体具有α7-nAChR的ECD和GlyR1的TMD[13]。因此，环II中的T34、T36和R37残基被鉴定为可能的界面贡献者。这些开创性研究为Lynx1–α7-nAChR相互作用提供了首个结构假说，但受限于当时缺乏α7-nAChR的实验结构
本研究的优势与局限性 使用水溶性Lynx1结构域使我们能够在可控浓度下研究该神经调节因子及其突变体的药理学特性，并获得其与受体相互作用的定量特征，而不仅仅是使用GPI锚定Lynx1时可获得的定性信息。另一项创新是双向丙氨酸扫描突变，使我们能够表征两个参与伙伴（ws-Lynx1和α7-nAChR）对相互作用的贡献，从而提供
生物化学意义与未来展望 无疑，通过冷冻电子显微镜等直接结构方法解析不同α7-nAChR状态下GPI锚定Lynx1的复合物结构，并与我们的结果进行比较，将极具意义。尽管由于结合相对较弱且具有可逆性，这可能是一个严峻的挑战。另一个极具研究价值的领域是确认GPI锚定糖链在与受体相互作用中的稳定作用，并评估其
结论 本文提出的结构模型揭示了Lynx1–α7-nAChR相互作用的若干新特征，并提出了变构调节的潜在机制。该模型预测了Lynx1–α7-nAChR复合物中的相互作用界面，可划分为两个簇群：第一个簇群负责复合物稳定性，包括Lynx1环III与受体亚基间界面的接触；第二个簇群包含Lynx1环II的R37残基以及
CRediT作者贡献声明 Maxim M. Zaigraev： 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，可视化，验证，方法学，调查，形式化分析，数据整理，概念化。Eugene A. Zhivov： 撰写——审阅与编辑，可视化，方法学，调查，形式化分析，数据整理。Timofey R. Chelyadinskii： 撰写——原稿撰写，可视化，验证，方法学，调查，数据整理。Mikhail A. Shulepko： 资源，方法学，调查。Dmitrii S.
伦理声明 所有动物护理和实验操作均按照《赫尔辛基宣言》以及欧洲共同体理事会1986年11月24日指令（86/609/EEC）和欧洲议会及欧盟理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的的动物的指令（2010/63/EU）的指导方针执行。实验经谢苗雅金-奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所伦理委员会批准
生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的使用声明 在撰写本文过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）、Claude（Anthropic）、Gemini（Google）和Perplexity AI来改善稿件的语言和可读性。在使用这些工具后，作者已对内容进行了审阅和必要编辑，并对发表内容承担全部责任。
资金来源 本工作得到俄罗斯科学基金会 （项目#24–14-00419）的支持。M.A.S.和H.Q.得到广东省普通高校创新研究团队项目（自然科学） 的支持，资助编号：2024KCXTD016。M.A.S.和Q.Z.得到SMBU国际联合项目"膜蛋白的结构与功能研究用于生物医学" 的支持。
利益冲突声明 作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢 感谢A.S. Paramonov博士通过NMR光谱对ws-Lynx1及其突变体进行的分析。
Maxim M. Zaigraev|Eugene A. Zhivov|Timofey R. Chelyadinskii|Mikhail A. Shulepko|Dmitrii S. Kulbatskii|Hong Qing|Quan Zhenzhen|Mikhail P. Kirpichnikov|Zakhar O. Shenkarev|Anton O. Chugunov|Ekaterina N. Lyukmanova
