《Food Bioscience》：Efficient Ergothioneine Production in
Saccharomyces cerevisiae through Synergistic Multilevel Metabolic Engineering and Adaptive Process Development
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•HIS1突变与SER3过表达协同作用缓解了代谢瓶颈。•在酿酒酵母中重构了甜菜碱驱动的甲基供体循环。•膜工程增强了胞外EGT分泌。•工程化酿酒酵母实现了最高EGT滴度（2.96 g/L）。•代谢组学揭示了升高的代谢物池和前体水平。引言L-麦角硫因（EGT）是一种罕见的天然含硫
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HIS1突变与SER3过表达协同作用缓解了代谢瓶颈。
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在酿酒酵母中重构了甜菜碱驱动的甲基供体循环。
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膜工程增强了胞外EGT分泌。
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工程化酿酒酵母实现了最高EGT滴度（2.96 g/L）。
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代谢组学揭示了升高的代谢物池和前体水平。
引言
L-麦角硫因（EGT）是一种罕见的天然含硫氨基酸衍生物，由于其独特的硫酮-巯基互变异构结构，表现出卓越的抗氧化稳定性和生物活性[1], [2], [3]。作为一种通过OCTN1摄取进入细胞的必需饮食细胞保护剂，EGT能够消除自由基、螯合重金属、保护线粒体并缓解炎症[4], [5], [6]。它在食品、化妆品和药物领域具有广泛应用，被誉为"长寿维生素"[7]。目前，EGT可通过天然提取、化学合成、酶法/生物转化和微生物发酵获得[8], [9], [10]。不同的生产方法在原料来源、反应条件、工艺复杂性和大规模应用潜力方面各有特点[11], [12], [13], [14]。相关生产策略的系统比较见表S1。其中，微生物发酵因其环境友好、安全高效而成为主流生产策略。
在自然界中，EGT的生物合成主要发生在真菌和某些细菌中[15], [16]。该过程以L-组氨酸（L-His）为核心前体，需要含硫底物和甲基供体的协同参与[17]。以真菌生物合成途径为代表（图S1），EGT生物合成通常由两个关键酶Egt1和Egt2催化[18]。首先，Egt1是一种多功能酶，利用S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体催化L-His的甲基化，生成三甲基化中间产物hercynine[19]。随后，该中间产物与来自L-半胱氨酸（L-Cys）的硫供体发生氧化偶联反应，形成关键含硫中间产物S-(hercyn-2-yl)-L-半胱氨酸亚砜。最后，在Egt2的催化下，该中间产物通过C-S键重排和脱羧反应转化为EGT[20], [21]。该生物合成途径高度依赖前体的供应，包括L-His和L-Cys，以及甲基供体SAM。此外，该过程涉及多个氧化还原反应，因此对细胞代谢状态和资源分配提出了巨大需求。与涉及多个特异性酶和更复杂代谢网络的细菌途径相比，真菌的两酶系统具有代谢负荷降低和工程可行性更高的优势[22], [23], [24]，为在微生物宿主中构建高效异源生物合成系统提供了清晰的理论框架。
为了实现该途径在工程宿主中的高效表达并最大化代谢通量，选择和优化合适的微生物底盘是关键的第一步。在各种微生物宿主中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）凭借其公认的安全性（GRAS）状态、稳健的工业发酵性能和成熟的遗传操作体系，已成为EGT生产的理想平台[25], [26], [27]。尽管先前的研究通过异源表达生物合成酶实现了EGT的初步积累，但现有工程菌株仍面临多种代谢瓶颈，严重限制了生产能力和工业适用性[28]。这些局限性大致可分为三个方面[29]。首先，向直接前体L-His和L-Cys的固有生物合成通量不足，且经常受到反馈抑制和竞争性代谢途径的制约。其次，随着前体供应的增强，SAM再生成为新的限速步骤，因为胞内SAM易被多胺生物合成等竞争性途径消耗，无法满足高水平EGT生产的需求。最后，发酵过程中EGT倾向于在胞内积累，这可能导致反馈抑制并增加下游处理成本[18]。此外，适应性发酵工艺与重构代谢网络之间的不匹配进一步制约了整体生物合成效率。适应性工艺优化对于将合成生物学菌株转化为工业应用至关重要。例如，Zhou等人通过优化培养基并开发两阶段溶氧控制策略，显著提高了番茄红素产量[30]。因此，高性能菌株工程与适应性工艺开发的协同对于克服瓶颈和提高产量至关重要。
因此，实现高效的EGT生产不能仅依赖单一靶标的修饰，而需要系统化的多层次优化策略。基于"逐步消除代谢瓶颈"的设计原则，本研究从多个维度系统优化了酿酒酵母中的EGT生物合成，包括前体供应、甲基供体循环、产物分泌和发酵工艺。具体而言，通过关键酶工程增强了L-His和L-Cys的生物合成通量。引入异源甲基供体途径，并减弱竞争性消耗，重构了甲基化循环，实现高效SAM供应。此外，膜透性工程结合发酵条件优化显著增强了EGT的生物合成和分泌。此外，采用比较代谢组学分析阐明了高产菌株背后的代谢重编程机制。本研究不仅通过代谢工程提高了酿酒酵母的EGT生产能力，还开发了高性能菌株的适应性工艺，协同提高了EGT生物合成，为工业应用奠定了坚实基础。
各节摘要
菌株与培养条件
本研究中使用的菌株列于表S2中。质粒构建使用大肠杆菌Trans1-T1和Trans110，在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl）中于37°C、200 rpm培养，必要时添加氨苄青霉素（100 μg/mL）。该菌株衍生自ST.12，即我们先前研究构建的酿酒酵母BY4741（MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0）的多层次工程衍生物[28]。常规培养和
基于前体供应增强的关键酶工程与组合优化
在我们先前的工作中，通过PoEgt1/PoEgt2的多拷贝过表达结合系统代谢工程，构建了一个高产酿酒酵母菌株ST.12，实现了108.33 ± 0.96 mg/L的EGT滴度[28]。然而，尽管在菌株构建过程中对L-His和L-Cys生物合成途径进行了工程改造，代谢组学分析显示，这两种氨基酸在发酵早期仍迅速耗竭，表明其供应
结论
本研究系统实施多维工程策略解决酿酒酵母中EGT生物合成的关键瓶颈，包括前体供应不足、甲基供体循环效率低和胞内产物积累。首先，通过HIS1点突变和SER3过表达增强前体供应。其次，通过引入异源BHMT途径和删除SPE2基因重构甲基供体循环。最后，
CRediT作者贡献声明
Zhongjuan Di：撰写—初稿、软件、方法学、形式分析、数据管理、概念构思。Yanjun Huo：撰写—初稿、监督、方法学。Bo Li：撰写—审阅与编辑、监督、方法学。Yingping Zhuang：撰写—审阅与编辑、项目管理、方法学、资金获取
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述工作的结果。
致谢
本研究得到国家重点研发计划（绿色生物制造项目：2021YFC2101100）的支持。
Zhongjuan Di|Yanjun Huo|Bo Li|Yingping Zhuang
