通过互补的生物干预措施，将发酵前的葡萄糖氧化与橄榄念珠菌发酵相结合，以减少长相思白葡萄酒中的乙醇含量

《Food Bioscience》：Integrating pre-fermentative glucose oxidation with Candida oleophila fermentation through complementary biological interventions for ethanol reduction in Sauvignon Blanc wine

　　

- 发酵前的葡萄糖氧化可选择性地减少葡萄汁中的可发酵葡萄糖。
- 葡萄糖氧化酶（GOX）处理增强了油酵母在整个发酵过程中的持续存活能力。
- 该综合策略在不进行脱醇处理的情况下，将葡萄酒中的乙醇降低了1.75%（v/v）。
- 3-甲硫基-1-丁醇和3-甲硫基-1-丁酸得到了保留，而仅4-甲氧基-4-甲基-2-戊酮表现出中等程度的降低。
- 该研究为综合生物乙醇减量建立了概念验证。

引言

葡萄酒行业正日益面临气候变化对葡萄成分、发酵管理和最终葡萄酒质量所造成的挑战。气温升高和成熟动态的改变促进了葡萄中过量糖分的积累，经常导致葡萄酒乙醇含量过高。这一趋势具有重要的技术和商业意义，因为高酒精浓度会改变葡萄酒的平衡度、香气感知、微生物稳定性、税收分类以及消费者接受度，特别是在对低酒精葡萄酒需求持续增长的市场上。因此，开发既能降低乙醇生成，又能保留品种典型性和整体葡萄酒质量的策略，已成为现代葡萄酒生物技术的一项主要目标。

降低乙醇含量的策略可在酒精发酵之前、期间或之后实施。发酵后技术包括膜分离、真空蒸馏、旋转锥形柱及相关脱醇工艺，能有效从成品酒中去除乙醇。然而，这些物理方法也可能改变香气组成、口感和感官平衡，尤其是在需要大幅降低酒精含量时。作为替代方案，生物策略越来越受到关注，因为它们旨在减少乙醇的生成，而不是在发酵后去除乙醇。其中，提前采摘葡萄可减少糖分积累，但可能会损害酚类物质的成熟度、品种香气的形成和整体感官质量。因此，在葡萄达到技术成熟度后能够调节可发酵糖可用性的生物方法，成为生产低酒精葡萄酒同时最大限度减少葡萄酒质量不良影响的一种有吸引力的替代方案。

一种有前景的发酵前策略是利用葡萄糖氧化酶对葡萄糖进行选择性氧化。该酶催化β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸-δ-内酯，随后水解为D-葡萄糖酸，同时生成过氧化氢。由于葡萄糖酸在酒精发酵过程中不会被代谢，该反应减少了可用于乙醇生产的可发酵底物。先前的研究表明，葡萄糖氧化酶处理可以有效降低葡萄汁的潜在酒精含量。有研究报告了在葡萄糖氧化后乙醇潜在含量的显著降低，尽管葡萄糖酸的形成伴随着酸度的增加。类似地，有研究证明了使用葡萄糖氧化酶处理后品乐塔葡萄酒中乙醇的降低，而另有研究表明葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶系统减少了佳美娜葡萄汁中乙醇的生成，同时最大限度减少了曝气过程中的氧化性颜色变化。

尽管取得了这些令人鼓舞的结果，基于葡萄糖氧化酶的策略仍受到若干技术挑战的制约。酶促效率很大程度上取决于葡萄汁pH值、氧气可用性、温度、酶用量和反应时间。此外，在葡萄糖氧化过程中会按化学计量生成过氧化氢。虽然过氧化氢本身不是自由基，但它可能通过金属催化的反应促进活性氧物种的形成，并参与二氧化硫、酚类化合物、色素、挥发性硫醇、维生素及其他氧化还原敏感成分的氧化。这些反应可能促进褐变、香气损失、抗氧化能力的改变和氧化稳定性的降低。因此，过氧化氢酶的使用已被研究作为一种互补策略，用于分解过氧化氢并限制葡萄糖氧化酶处理过程中的氧化。因此，基于葡萄糖氧化酶的工艺不仅需要优化葡萄糖耗竭与葡萄糖酸积累之间的平衡，还需要控制过氧化氢的暴露及其对葡萄酒组成和稳定性的潜在影响。

一种互补的生物策略涉及使用非酿酒酵母。与酿酒酵母相比，许多非酿酒酵母菌种表现出更低的乙醇产率，因为部分碳通量被重新导向生物量形成、甘油、有机酸和其他次级代谢产物。因此，耐热异常酵母、德氏墨卡酵母、美丽克勒克酵母、巴氏斯特马酵母和贝亚瑞克酵母等物种已被广泛研究作为降低乙醇含量同时增加葡萄酒复杂性的生物工具。然而，许多这些酵母对乙醇的耐受性有限，通常需要与酿酒酵母序贯接种以确保发酵完全。

在此背景下，油酵母代表了一个特别引人关注的非酿酒酵母物种，因为先前的研究表明其能够在发酵过程中减少乙醇产量同时对葡萄酒组成产生积极贡献。虽然非酿酒酵母通常与酿酒酵母序贯接种以促进发酵完成，但油酵母在受控实验室条件下作为单一启动培养物评估时也表现出了保持代谢活跃的能力。尽管如此，其相对较低的乙醇耐受性仍是限制其更广泛酿酒应用的主要制约因素之一。因此，我们假设在发酵前减少可发酵葡萄糖可以减轻乙醇相关的胁迫，并提高油酵母的持续存活能力和发酵性能。在本研究中将其作为单一启动培养物使用，旨在隔离其对葡萄糖氧化酶处理的响应，而非建立可直接用于工业实施的发酵方案。

虽然发酵前葡萄糖氧化和非酿酒酵母发酵已各自独立得到研究，但将两者作为互补的生物干预措施进行整合却鲜有关注。尚无研究系统评估发酵前的选择性葡萄糖耗竭能否改善油酵母的生理表现，同时增强长相思白葡萄酒中的乙醇减量。这代表了一个重要的知识空白，因为发酵前糖分调节不仅可以直接减少乙醇的生成，还可能为对乙醇敏感的非酿酒酵母创造更有利的发酵环境。因此，本概念验证方法旨在确定葡萄糖氧化酶介导的葡萄糖耗竭后油酵母在受控实验室条件下的具体贡献，同时认识到后续需要与酿酒酵母进行验证以评估发酵完成度和工业适用性。因此，本研究的目标是评估将发酵前葡萄糖氧化与油酵母发酵整合作为互补生物策略以减少长相思白葡萄酒中乙醇生成的可行性。具体而言，我们评估了葡萄糖氧化酶用量和曝气对葡萄糖耗竭和葡萄糖酸形成的影响，评估了优化后的酶处理对长相思葡萄汁组成的影响，确定了其对油酵母发酵性能和持续存活能力的影响，并表征了所得葡萄酒的组成，包括乙醇、残糖、有机酸、甘油和选定的长相思品种硫醇。我们假设发酵前的部分葡萄糖氧化不仅会减少乙醇的生成，还会创造一种限制性更小的发酵环境，从而提高油酵母作为单一启动培养物的持续存活能力，同时使主要的品种硫醇保持在与未处理葡萄酒可比较的范围内。

葡萄材料

长相思葡萄汁于2022年收获季节从智利兰卡瓜的埃米利亚纳葡萄园（洛斯罗布莱斯酒庄）获得。葡萄在技术成熟时采摘，并在冷藏条件下运输至智利天主教大学微生物发酵实验室。到达后立即处理葡萄，葡萄汁的初始理化特性——包括可溶性固形物（通过数字折光法测量）——如下所述。

葡萄糖氧化酶处理的优化和可发酵糖的调节

将葡萄糖氧化酶应用于合成葡萄汁产生了明显的活性依赖性葡萄糖浓度降低，同时伴随葡萄糖酸形成的按比例增加（表1）。这些结果证实了葡萄糖氧化酶对葡萄糖的选择性氧化，并表明该酶处理有效地减少了酒精发酵前可发酵糖的储备量。由于葡萄糖氧化酶专门氧化β-D-葡萄糖而不影响果糖，因此该处理特异性地针对葡萄糖进行氧化。

结论

本研究证明，发酵前葡萄糖氧化可以成功地与非酿酒酵母油酵母发酵整合，作为在受控实验室条件下减少长相思白葡萄酒中乙醇生成的互补生物策略。选择性葡萄糖氧化改变了葡萄汁的初始可发酵糖组成，导致乙醇产量降低，同时促进了油酵母在发酵过程中的持续存活能力。

生成式人工智能和AI辅助技术在稿件准备过程中的声明

在准备修订稿件过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来协助语言改进、清晰度和可读性。使用此工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对稿件内容承担全部责任。

作者贡献声明

Alejandra Urtubia：资源、调查、资金获取、概念化。
Sergio Benavides-Valenzuela：写作—审阅与编辑、验证、监督、方法学、调查、形式分析。
Wendy Franco：写作—初稿撰写、监督、资源、调查、形式分析、概念化。
Carla Vargas：写作—初稿撰写、调查、数据管理。
Consuelo Ceppi De Lecco：写作—审阅与编辑、验证、方法学、调查。

参与同意

不适用。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

竞争性利益声明

作者声明，他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。

数据可用性

支持本研究结果的数据可向通讯作者合理请求获取。

伦理批准

不适用。本研究不涉及人类参与者或实验动物。

发表同意

不适用。

生成式人工智能和AI辅助技术在稿件准备过程中的声明

在本工作准备过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来支持语言编辑，并提高稿件的清晰性、组织性和一致性。该工具未用于生成或分析实验数据。作者根据需要审查和编辑了输出内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

资金支持

智利国家研究与开发署 FONDEF IDeA 项目编号19I10340（智利）

资金支持

本研究由智利国家研究与开发署通过FONDEF IDeA项目编号19I10340资助。

竞争性利益声明

作者声明，他们没有任何已知的竞争性财务利益、商业关联或个人关系可能影响本论文中报告的工作。本研究中使用的商业葡萄糖氧化酶制剂仅作为实验试剂使用，其制造商在研究设计、数据收集、数据分析、稿件准备或发表决定方面均未发挥作用。

致谢

作者感谢智利国家研究与开发署通过FONDEF IDeA项目编号19I10340提供的财务支持。

W. Franco | C. Vargas | C. Ceppi De Lecco | A. Urtubia | S. Benavides-Valenzuela