《Food Bioscience》：Blueberry attenuates oxidative stress-associated signals and neutral lipid accumulation in 2D and 3D hepatic cell models
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蓝莓（Vaccinium spp.）富含多酚类物质，具有抗氧化和调节代谢的潜力，但其对肝脏细胞的影响尚需进一步研究。本研究采用了一种多层次的实验策略，评估了经最低限度加工的食物级蓝莓匀浆澄清液（HCB）在二维（2D）和三维（3D）肝脏模型中的细胞效应。首先，利
蓝莓（Vaccinium spp.）富含多酚类物质，具有抗氧化和调节代谢的潜力，但其对肝脏细胞的影响尚需进一步研究。本研究采用了一种多层次的实验策略，评估了经最低限度加工的食物级蓝莓匀浆澄清液（HCB）在二维（2D）和三维（3D）肝脏模型中的细胞效应。首先，利用基于INFOGEST的静态体外消化模型对HCB进行表征，并通过紫外-可见分光光度法和高效液相色谱（HPLC）法分析其在口腔、胃和肠各阶段的总酚含量及特定酚类化合物。结果显示，模拟消化后，约94%的胃期总酚在肠期仍可检测到。随后，研究人员在HepG2细胞中评估了HCB对基础状态下氧化应激相关信号、炎症标志物、脂质代谢基因表达的影响，并利用刺激拉曼散射（SRS）显微镜技术无标记地可视化和量化细胞内脂滴（LDs）。研究发现，HCB（15 μg/mL没食子酸当量，GAE）处理降低了HepG2细胞的氧化应激相关信号，下调了磷酸化ERK1/2和核因子κB（NF-κB）蛋白水平，同时上调了去乙酰化酶SIRT1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）的表达。此外，HCB还减少了HepG2细胞的基础中性脂质蓄积，并调控了脂质代谢相关基因的表达。在油酸/棕榈酸（OA/PA）诱导的脂质负载HepaRG细胞模型中，HCB显著减轻了脂肪酸诱导的中性脂质蓄积。在转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的三维（3D）HepG2/LX-2肝球体模型中，HCB处理减弱了TGF-β1诱导的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原蛋白（COL1A1）阳性面积增加，并减少了球体内的中性脂质蓄积，同时下调了脂滴包被蛋白2（PLIN2）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）的mRNA表达。这些结果表明，一种食物级的蓝莓制备物能够在互补的2D和3D肝脏系统中减轻氧化应激相关信号和中性脂质蓄积，并调节纤维化相关标志物。
论文解读文章
1. 研究背景与目的
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）已成为全球最普遍的慢性肝病之一，影响着约38%的成年人，其疾病谱涵盖从单纯性脂肪变性到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、进展性纤维化、肝硬化乃至肝细胞癌。MASLD的发病机制是多因素的，涉及代谢失调、脂毒性、氧化应激和慢性炎症的自我放大循环。尽管甲状腺激素受体β激动剂Resmetirom已获批用于治疗伴有中重度纤维化的非肝硬化MASH，但其适用人群有限，凸显了对安全、基于食物的干预策略的需求。地中海饮食模式和多酚丰富的膳食方案与较低的MASLD患病率和严重程度相关，这为营养补充策略提供了依据。蓝莓因其富含多达25种花青素以及黄酮醇、黄烷-3-醇等植物化学物而备受关注，这些化合物被认为是有效的抗氧化剂和自由基清除剂，能够调节与代谢性肝病相关的信号通路。然而，以往的大多数机理研究使用的是纯化的花青素组分，而非经过最低限度加工的、来源于食物的基质，限制了其直接的转化相关性。因此，本研究旨在利用一种结合了体外消化、化学表征、脂质特异性成像以及互补的2D和3D肝脏系统的综合方法，评估一种最低限度加工的、食物级蓝莓匀浆澄清液（HCB）的细胞效应。
2. 主要关键技术方法
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，使用定制的、基于INFOGEST的静态体外胃肠消化模型模拟蓝莓的消化过程。其次，通过紫外-可见分光光度法和高效液相色谱（HPLC）法对消化各阶段的样品进行总酚含量（TPC）和特定酚类化合物的定性与定量分析。在细胞层面，利用荧光探针CellROX? Green评估活性氧（ROS）相关氧化应激；采用油红O（ORO）染色、AdipoRed?荧光染色和刺激拉曼散射（SRS）显微镜技术分别定性和定量分析细胞内中性脂质和脂滴（LDs）。通过免疫荧光染色检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原蛋白（COL1A1）的表达。使用蛋白质印迹法（Western blotting）和细胞原位Western（In-Cell Western）技术分析关键信号蛋白的水平。最后，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测脂质代谢、氧化还原和铁稳态相关基因的mRNA表达。
3. 研究结果
体外消化释放蓝莓多酚并保留抗氧化活性
模拟消化显示，蓝莓在胃期的总酚含量最高（471.73 ± 1.91 mg GAE/100g），且在肠期仍保留了约94%的胃期总酚（443.96 ± 9.89 mg GAE/100g）。抗氧化活性（DPPH和ABTS法）在肠期达到最高。HPLC分析鉴定出儿茶素、芦丁和槲皮素为主要酚类化合物，其中儿茶素在各消化阶段含量均最高。
HCB降低HepG2细胞氧化应激并调节氧化还原及铁相关mRNA
在HepG2细胞中，15 μg/mL GAE浓度的HCB处理未影响细胞活力。与未处理组相比，HCB显著降低了细胞内的ROS相关氧化应激信号（CellROX阳性面积/核数减少）。分子水平上，HCB处理降低了磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）与总ERK1/2的比例以及总的核因子κB（NF-κB）蛋白水平，同时增加了去乙酰化酶SIRT1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）的蛋白水平，但对磷酸化AMP活化蛋白激酶α（p-AMPKα）无显著影响。此外，HCB上调了抗氧化转录因子NFE2L2的mRNA表达，并差异性地调节了铁稳态相关基因：下调了IREB2、ACO1、TFRC和FTL，上调了FTH1和SLC40A1。
HCB降低HepG2细胞基础脂滴蓄积并调节脂质代谢基因
通过SRS显微镜成像，研究人员发现HCB处理的HepG2细胞中，脂滴面积与细胞面积的比值比未处理组降低了51.4%，表明细胞内脂滴数量更少、丰度更低。这一结果得到了ORO和AdipoRed染色的支持。基因表达分析显示，HCB显著下调了与过氧化物酶体脂肪酸氧化相关的PPARα和ACOX1，但上调了线粒体脂肪酸氧化关键基因CPT1α。在从头脂肪生成途径中，SREBP1c和ACACA表达显著降低，而ACLY升高，SCD1不变。HCB还显著下调了甘油三酯合成基因DGAT1和葡萄糖响应性脂肪生成调节因子ChREBP，以及极低密度脂蛋白（VLDL）组装相关基因MTTP和APOB，而对胆固醇代谢基因SREBP2和HMGCR无显著影响。
HCB减轻HepaRG细胞中OA/PA诱导的中性脂质蓄积
在经油酸/棕榈酸（OA/PA）混合物处理以诱导脂质负载的HepaRG细胞中，HCB共处理显著降低了由脂肪酸引起的中性脂质蓄积，表现为ORO阳性面积减少。
HCB减轻3D HepG2/LX-2球体中TGF-β1诱导的纤维化相关标志物
在转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的3D HepG2/LX-2肝球体模型中，与单独TGF-β1处理组相比，HCB共处理显著减弱了α-SMA和COL1A1的免疫荧光阳性面积，并降低了COL1A1的mRNA表达。同时，HCB也减少了球体内的中性脂质蓄积，并下调了脂滴包被蛋白2（PLIN2）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）的mRNA水平。在此过程中，球体的体积和三磷酸腺苷（ATP）含量未受显著影响。
4. 讨论与结论总结
本研究的贡献在于使用一种最低限度加工的、食物级的蓝莓制备物（HCB），在一个整合了模拟消化、两种互补肝细胞模型和3D肝细胞/星状细胞共培养体系的实验框架内，表征了其对肝脏细胞的效应。研究表明，HCB能够降低基础状态下的氧化应激相关信号，并调节参与炎症信号、抗氧化反应、铁稳态和脂质代谢的蛋白与基因。研究观察到SIRT1、PGC-1α和ATGL蛋白水平的共同升高，可能反映了与脂滴代谢相关的相互关联的通路的调节。SRS显微镜作为一种化学特异性的无标记成像技术，直观显示了HCB处理后脂滴的减少。在3D球体模型中，HCB对TGF-β1诱导的α-SMA和COL1A1的抑制作用，与先前关于浆果来源的花青素抗纤维化作用的证据一致。
研究结论总结如下：
HCB降低了HepG2细胞中基础氧化应激相关信号和中性脂质相关信号，并减轻了HepaRG细胞中OA/PA诱导的中性脂质蓄积。在TGF-β1刺激的HepG2/LX-2球体中，HCB在不影响球体体积或ATP含量的前提下，减少了中性脂质蓄积、α-SMA和COL1A1阳性面积以及PLIN2和PPARG的mRNA表达。总体而言，这些发现描述了在互补的2D和3D肝脏系统中，一种最低限度加工的HCB所引起的细胞反应。然而，该研究并未确定活性化合物或建立特定的因果分子机制。进一步的体内和临床研究可能有助于阐明这些发现的生物学意义和潜在的转化价值。
