轮叶八宝（Hylotelephium verticillatum）叶片发育阶段依赖的山柰酚衍生物变化及其抗氧化、抗菌与群体感应抑制活性研究

《Food Chemistry: X》：Developmental stage-dependent changes in kaempferol derivatives and associated antioxidant, antibacterial, and quorum sensing inhibitory activities in Hylotelephium verticillatum leaves

　　

摘要专业翻译 本研究考察了轮叶八宝（Hylotelephium verticillatum）早期发育过程中第一真叶（FLH）与第二真叶（SLH）乙醇提取物的植物化学特征及生物活性。研究人员评估了总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、抗氧化、抗菌及群体感应（QS）抑制活性，并利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱-电喷雾串联质谱（UPLC-Q-Orbitrap-ESI-MS/MS）和高效液相色谱（HPLC）对主要黄酮类化合物进行了表征。SLH的TPC显著高于FLH，而TFC无显著差异。尽管FLH的TPC较低，但其表现出更强的ABTS自由基清除、抗菌及QS抑制活性（基于扩散法测定）。植物化学分析表明，山柰酚衍生物为主要成分，并呈现明显的发育阶段依赖性变化。相关性与层次聚类分析显示，生物活性与特定黄酮成分的相关性高于与总酚积累的相关性。上述发现表明，早期叶片发育显著影响轮叶八宝的黄酮组成及生物活性，凸显了山柰酚衍生物在该可食物种中的功能重要性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

植物产生包括酚类化合物和黄酮类化合物在内的大量次生代谢产物，这些代谢产物在植物生长、防御及环境胁迫适应中发挥关键作用，并因其多样的生物活性——尤其是抗氧化和抗菌特性——而被视为药物和食品领域中合成试剂的天然替代品。在食品工业中，植物源酚类物质不仅因其促进健康的功能特性而备受重视，还可作为能够抑制食源性病原菌和防止脂质氧化的天然防腐剂。此外，许多酚类化合物和黄酮类化合物已被证明能够干扰细菌的群体感应（QS）通讯系统，从而在不施加强烈选择压力的情况下抑制毒力和生物膜形成，有助于避免抗菌耐药性的发展。

次生代谢物的积累具有高度动态性，受发育阶段、组织类型和环境条件等因素影响。叶片在早期发育过程中经历广泛的代谢变化，这可能显著改变次生代谢物的组成和丰度。从饮食和农业角度看，这些早期发育阶段往往与叶菜类蔬菜的最佳采收期重合，此时幼嫩组织具有柔软、可口等理想感官品质。第一和第二真叶代表植物建植和存活的关键阶段，此期间化学防御系统可能尤为重要。然而，尽管这些早期发育阶段具有生态和生理意义，叶片个体发育、植物化学积累与生物活性之间的关系仍知之甚少。

轮叶八宝（Hylotelephium verticillatum）隶属于景天科（Crassulaceae）八宝属（Hylotelephium），该属物种具有作为野生可食绿叶菜或沙拉蔬菜的传统食用历史，尤其在其柔嫩生长阶段被鲜食。然而，现有关于八宝属的研究主要集中在分类学、园艺特性和基因组学方面，其植物化学组成和生物活性受到的关注相对较少。轮叶八宝尤为缺乏研究，关于其代谢物谱和生物活性潜力的信息有限，且尚无研究探讨早期叶片发育如何影响该物种生物活性代谢物的积累及相应生物活性。因此，本研究旨在填补这一空白，系统评估早期叶片发育阶段对轮叶八宝植物化学组成和生物活性的影响。

二、研究内容与意义

研究人员以轮叶八宝的第一真叶（FLH）和第二真叶（SLH）为研究对象，比较了发育进程对酚类和黄酮类化合物积累及其相关自由基清除、抗菌和QS抑制活性的影响。研究发现，尽管SLH的总酚含量（TPC）显著高于FLH，但FLH表现出更强的ABTS自由基清除、抗菌和QS抑制活性。植物化学分析揭示山柰酚衍生物为主要成分，且呈现明显的发育阶段依赖性变化：双糖苷类化合物如山柰酚3,7-二-O-鼠李糖苷和山柰酚7-O-新橙皮糖苷在FLH中含量更高，而单糖苷类化合物如山柰酚3-O-葡萄糖苷、山柰酚3-O-鼠李糖苷和山柰酚7-O-鼠李糖苷在SLH中积累更多。相关性和层次聚类分析表明，生物活性与特定黄酮成分的相关性高于与总酚积累的相关性。这些发现证实早期叶片发育显著影响轮叶八宝的黄酮组成和生物活性，凸显了山柰酚衍生物在该可食物种中的功能重要性，为确定最大化膳食健康益处和功能功效的精确采收窗口提供了科学依据。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：第一，利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱-电喷雾串联质谱（UPLC-Q-Orbitrap-ESI-MS/MS）对FLH提取物进行全面的植物化学 profiling，在正负离子双模式下实现了12种成分的初步鉴定；第二，采用高效液相色谱（HPLC）结合紫外检测器，利用六种山柰酚类标准品建立校准曲线，对主要黄酮类化合物进行定量分析；第三，采用福林-酚比色法和三氯化铝比色法分别测定TPC和TFC；第四，通过ABTS和DPPH两种自由基清除实验评估抗氧化活性；第五，采用琼脂孔扩散法和刃天青（resazurin）微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；第六，利用紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）作为生物传感器菌株评估QS抑制活性。植物材料于2025年4月初在韩国京畿道林业环境研究中心（GFERC）田间种植，发芽后20天采集FLH和SLH叶片。

四、研究结果

TPC和TFC含量：SLH的TPC（103.0 mg TAE/g提取物）显著高于FLH（75.4 mg TAE/g提取物）（**p < 0.01），表明叶片发育过程中酚类物质积累增加；而FLH（6.87 mg QE/g提取物）与SLH（7.10 mg QE/g提取物）的TFC无显著差异，说明总黄酮含量在两个早期发育阶段之间保持相对稳定。

自由基清除活性：ABTS实验中，SLH的IC₅₀值（15.14 mg/mL）显著高于FLH（12.95 mg/mL）（***p < 0.001），表明较成熟叶片的自由基清除活性较低；而DPPH实验中FLH（20.89 mg/mL）与SLH（21.26 mg/mL）之间无显著差异，提示两个发育阶段的自由基清除能力相当。

抗菌活性：两种提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均表现出强抗菌活性，FLH产生的抑菌圈（16 mm）显著大于SLH（14 mm）（p < 0.05），但两者的MIC（<0.391 mg/mL）和MBC（0.391 mg/mL）相同；对大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性明显较低，FLH抑菌圈为9 mm，SLH为7 mm，两者的MIC为12.5 mg/mL，MBC为25 mg/mL。总体上，两种提取物对革兰氏阳性菌的活性显著强于革兰氏阴性菌。

QS抑制活性：FLH产生的平均透明圈为12.6 mm，抗QS圈为2.10 mm；SLH产生的平均透明圈为10.2 mm，抗QS圈为1.87 mm。虽然FLH的抗QS圈数值上大于SLH，但差异未达到统计学显著水平（p > 0.05），表明两种提取物均具有干扰紫色杆菌紫色杆菌素产生的潜力。

UPLC-Q-Orbitrap-ESI-MS/MS植物化学分析：在FLH提取物中初步鉴定出12种成分，主要包括酚酸类（没食子酸、咖啡酸、对香豆酸、邻香豆酸）和多种山柰酚糖苷类化合物（山柰酚7-O-新橙皮糖苷、山柰酚3-O-鼠李糖苷7-O-木糖苷、山柰酚3,7-二-O-鼠李糖苷、山柰酚3-O-葡萄糖苷、山柰酚3-O-鼠李糖苷、山柰酚7-O-鼠李糖苷），以及达提斯素（datiscetin）和山柰酚。黄酮糖苷类构成提取物中主要的代谢物类别。

HPLC定量分析：山柰酚3,7-二-O-鼠李糖苷（化合物1）是两种提取物中的主要成分，在FLH中含量（12.89 mg/g提取物）高于SLH（10.37 mg/g提取物）；山柰酚7-O-新橙皮糖苷（化合物2）和山柰酚（化合物6）同样在FLH中含量更高；相反，山柰酚3-O-葡萄糖苷（化合物3）、山柰酚3-O-鼠李糖苷（化合物4）和山柰酚7-O-鼠李糖苷（化合物5）在SLH中含量更高，其中山柰酚7-O-鼠李糖苷的差异最为显著，从FLH的4.28 mg/g提取物增至SLH的9.19 mg/g提取物。这些结果证实了两个叶片阶段之间黄酮组成的显著发育阶段依赖性差异。

五、讨论与结论

讨论部分指出，SLH中显著较高的TPC反映了叶片成熟过程中酚类化合物积累的增加，可能与其发育相关的生理适应有关。然而，FLH尽管TPC较低却表现出更强的ABTS自由基清除活性，这反映了特定黄酮成分的组成和相对丰度差异而非总酚或总黄酮含量的普遍增加。ABTS与DPPH实验间的差异可归因于自由基结构、反应机制、空间可及性和溶解度特性的不同。抗菌活性方面，革兰氏阴性菌较低敏感性归因于其外膜脂多糖屏障以及孔蛋白和外排泵的作用。FLH与SLH在琼脂扩散实验中抑菌圈的差异可能受提取物中可扩散成分的扩散性、溶解度和相对丰度影响，而MIC和MBC采用二倍梯度稀释法测定，较小的效力差异不足以改变浓度终点。QS抑制活性方面，两种提取物均能抑制紫色杆菌素的产生，表明轮叶八宝提取物可作为植物源抗生物膜和抗菌策略的潜在来源。山柰酚糖苷的发育阶段差异表明叶片成熟过程中黄酮糖基化模式的动态调控，双糖苷在幼叶中的优势可能与其增强的水溶性和化学稳定性有关，具有食品、制药和化妆品应用的潜在价值。相关性分析进一步证实抗菌和QS抑制活性与特定山柰酚衍生物的相关性高于与TPC的相关性，强调了发育调控黄酮生物合成和糖基化在决定提取物生物活性中的重要性。

研究结论指出，本研究为轮叶八宝黄酮生物合成的发育调控提供了新见解，并强调了定性植物化学变异在决定早期植物发育过程中功能生物活性方面的重要性。早期阶段叶片显著的生物活性和丰富的山柰酚糖苷谱表明，轮叶八宝作为一种高营养价值的野生可食沙拉绿叶菜以及功能性食品配料、天然抗氧化剂和膳食生物防腐剂的宝贵来源具有相当大的潜力。研究建议未来应通过化合物分离和核磁共振（NMR）分析进一步确认未鉴定成分的结构，评估单一化合物的生物活性及其在食品加工和消化条件下的稳定性，并深入研究黄酮生物合成调控机制，以全面阐明山柰酚衍生物在该可食物种中的代谢和功能意义。