离子特异性调控火麻蛋白 - 卡拉胶复合水凝胶的分级组装：从构象弛豫到不同的网络拓扑结构

《Food Hydrocolloids》：Ion-specific modulation of hierarchical assembly in hemp protein-carrageenan composite hydrogels: from conformational relaxation to distinct network topologies

　　

• 离子特异性效应调节大麻蛋白-卡拉胶分层组装。
• 最佳盐浓度触发结构松弛以暴露疏水位点和巯基位点。
• Na?形成细丝状网络；Ca2?诱导致密颗粒状组装。
• 最致密的拓扑结构将孔隙率降至最低，以在定制网络中牢固锁水。
• 多尺度分析将分子展开与宏观凝胶功能特性联系起来。

引言

由于世界人口预计到2050年将达到90亿，目前对高质量食品蛋白质的需求正在发生巨大变化（Plati, Ritzoulis, Pavlidou, & Paraskevopoulou, 2021）。由于供应有限、成本高以及对环境的巨大影响——即生物多样性丧失、淡水资源减少和温室气体排放——传统动物蛋白生产正日益受到审视（Almeida Sá, Moreno, & Carciofi, 2020; Zahari et al., 2020）。因此，迫切需要开展研究，探索可持续的植物基替代蛋白质，在满足人类膳食需求的同时将对环境的影响降至最低。在此背景下，源自大麻（*Cannabis sativa* L.）种子的工业大麻蛋白分离物（HPI）已作为一种功能食品配方的前景候选材料崭露头角。HPI的主要组分是大麻蛋白（edestin），一种类似豆蛋白的11S六聚体球蛋白，其中酸性和碱性多肽链通过二硫键紧密相连。HPI的特点是必需氨基酸（EAA）组成均衡，满足粮农组织/世界卫生组织对成年人的要求，同时具有高消化率、低致敏性以及独特的精氨酸-赖氨酸比值，后者对心血管健康有益（Chuang, Ye, Anema, & Loveday, 2020）。与传统植物蛋白体系（如大豆或豌豆蛋白分离物）不同，后者由异质性的7S/11S混合物组成，在加盐后会经历非特异性热变性和混乱的宏观聚集，HPI中对称的11S大麻蛋白六聚体展现出对受控结构松弛的独特能力。这种独特的分子结构使其能够在离子胁迫下实现部分四级/三级结构域展开，而非无约束沉淀。

尽管HPI在营养方面表现优异，但其工业应用经常受到次优技术功能特性的阻碍。食品工程中的一个关键挑战在于，单一组分的植物蛋白水凝胶往往表现出脆弱的三维网络，保水性（WHC）差且机械强度低。HPI尤其存在中性pH下溶解度极低的问题（约13-17%），这限制了其形成肉类类似物或可食薄膜等凝聚性食品基质所必需的均匀细丝状网络的能力（Shen et al., 2021）。此外，虽然近期研究已探讨了涉及蛋白-多糖相互作用的双组分体系，但关于三元HPI-多糖体系盐介导分层组装的系统性研究仍然稀缺（Cao and Mezzenga, 2020; Yang, Li, et al., 2021）。

弥合这些差距对于设计下一代植物基功能食品至关重要。通过多糖杂化与电解质调控构建复合亲水胶体体系，是克服功能瓶颈并开发先进可持续材料的稳健策略（Akbar et al., 2026）。卡拉胶（CA）是从红海藻中提取的线性硫酸化多糖，因其独特的冷凝固行为和多样的基质形成能力而被广泛用作结构增强剂（Akbar & Mustari, 2024; Tao et al., 2022; Liu, Duan, & Yang, 2023; Li, Zhou, et al., 2023; Xu, Jiang, et al., 2024）。卡拉胶通过填充效应以及冷却过程中卷曲-螺旋转变形成的物理连接区来实现结构强化（Pacheco-Quito, Ruiz-Caro, & Veiga, 2020; Bealer et al., 2020; Elmarhoum & Ako, 2021; Huang, Mao, Mao, & Yang, 2021）。此外，卡拉胶骨架上的负电荷有机硫酸盐基团能与蛋白分子上的正电荷区域产生协同静电相互作用，即使在高于蛋白质等电点的pH值下亦是如此（Wang et al., 2020; Li, Wang, et al., 2022; Lu, Lee & Yang, 2023）。

盐离子的存在决定了蛋白展开的热力学和胶体聚集的动力学，从根本上改变了凝胶化轨迹（Zhang, Jiang, et al., 2022）。虽然盐的调控作用已在简单的球状蛋白体系（如乳清蛋白和大豆蛋白）中得到广泛记录，但三元复合体系——特别是HPI-CA基质——中的机制路径仍是一个明显的知识空白。比较文献表明，虽然在大豆或豌豆蛋白-多糖水凝胶中添加盐主要通过非特异性盐析和宏观相分离来起作用，而HPI-CA复合物的离子介导调控则遵循多尺度结构松弛路径。在该体系中，盐离子充当精密的"热力学开关"，精细平衡大麻蛋白六聚体展开速率与网络渗流动力学。离子胁迫下蛋白质与多糖之间的相互作用并非简单的加和效应，而是一个高度竞争和动态的过程（Liu et al., 2022）。在HPI-CA-盐三元体系中，阳离子在蛋白和多糖的硫酸盐基团上的结合位点间竞争，可能改变每种生物聚合物的净电荷和水合状态，从而决定后续的共聚集路径。具体而言，选择Na?和Ca2?作为一价和二价原型的基准，因为它们代表了食品物理化学中两种根本不同的相互作用极点：纯静电双电层屏蔽（Na?）与特异性多齿配位桥接（Ca2?）。对比这两种机制极端，可直接阐明离子价态如何决定生物聚合物水合与交联之间的竞争。一价阳离子（如Na?）主要通过压缩电双层来发挥作用。这种静电屏蔽减弱了相同电荷的HPI分子和CA链之间的排斥能垒，理论上允许疏水片段逐渐缔合（Siddiqui et al., 2023）。相反，二价阳离子（如Ca2?）则发挥更具侵略性的调控作用。除了简单的电荷中和外，Ca2?具有特异性配位亲和力，作为分子间和分子内"桥梁"，连接蛋白的负电荷羧基与卡拉胶的酯硫酸盐基团（Udo et al., 2023）。

关于HPI的早期微观构象变化与晚期宏观凝胶拓扑结构之间直接因果关系的系统性、多尺度研究空白依然存在。不受控的加盐通常会引发混乱的过度聚集、严重的空间位阻抑制和大量水分排出，而非结构强化（Zhang, Liu, et al., 2020）。因此，阐明"受控结构松弛"与"随机微相分离"之间的热力学边界，对于工程化具有定制质构和水合特性的植物基基质至关重要（Man et al., 2023）。

为解决这一关键空白，本研究旨在从多尺度角度系统阐明HPI-CA复合水凝胶的盐介导分层组装机制（Wang et al., 2021）。采用动态光散射和分光光度法浊度演变来监测胶体聚集动力学和组装速率。通过内源性荧光、紫外-可见光谱、表面疏水性（H?）和可及巯基（-SH）分析来量化三级结构重排和内部功能位点的暴露（Fan et al., 2020）。通过非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进一步验证分子间交联。最后，通过质构剖面分析（TPA）、低场核磁共振（LF-NMR）、伪彩色磁共振成像（MRI）以及配备孔隙率分析的扫描电子显微镜（SEM）来评估宏观网络完整性和持水性（Lei et al., 2023; Ozel, Aydin, & Oztop, 2020）。

本研究为离子特异性调节植物蛋白-多糖架构提供了理论见解。本研究的独特新颖性在于解析了离子特异性微环境（Na? vs. Ca2?）如何控制大麻蛋白六聚体的受控、部分"结构松弛"——而非随机沉淀——以策略性暴露埋藏的疏水簇和反应性巯基作为"分子胶"。通过建立反应性分子位点协同暴露与最终凝胶连通性之间的稳健相关性，我们假设一价Na?将通过逐步电荷屏蔽促进均质细丝状网络的形成，而二价Ca2?将通过特异性桥接相互作用诱导更为局域化的颗粒状组装。最终，这一多尺度研究为配制高质量的定制大麻蛋白基功能水凝胶用于高级食品应用提供了理论框架和精确的技术参考。

分节摘要

材料

脱脂大麻粉购自辽宁乔牌生物科技有限公司（辽宁，中国），凯氏定氮法测得蛋白质含量为70.20%。κ-卡拉胶（CA）购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国）。NaCl和CaCl?分别购自江苏中禾精细化工有限公司（吴江，中国）和天津力克化学试剂有限公司（天津，中国）。本工作中使用的所有其他化学试剂均为分析纯。

HPI-CA复合凝胶的制备

工业大麻蛋白分离物（HPI）的制备

离子价态对粒径分布的影响

监测粒径分布的演变提供了洞察HPI-CA在热诱导过程中控制组装的分子间力微妙平衡的直观窗口（图1）。在无盐离子（0 mM）条件下，HPI-CA体系呈现典型的多分散分布特征，主要集中在20-100 nm范围内——这一范围对于球状植物蛋白而言较为典型，其中小亚基与预存聚集体共存。然而，引入一价Na?（50-100 mM）后，引发了显著的结构性……

结论

在本研究中，系统阐明了由一价（Na?）和二价（Ca2?）阳离子介导的HPI与CA复合水凝胶的多尺度分层组装机制。超越传统依赖非特异性热变性的蛋白-多糖共凝胶化范式，本研究证明最终的凝胶拓扑结构和宏观功能特性从根本上由大麻蛋白的早期离子特异性结构松弛所决定。

CRediT作者贡献声明

黄宇阳：方法论，形式分析。
朱颖：监督，资源获取。
刘琳琳：方法论，形式分析。
孙冰玉：方法论，形式分析。
卢明秀：撰写——初稿，资金获取，概念化。
曲敏：监督，资源获取。
朱秀清：监督，项目管理。
王振兴：撰写——审阅与编辑，可视化。
王梓涵：数据整理。
孙昊天：数据整理。

未引用参考文献

Huang et al., 2022; Li et al., 2022; Li et al., 2022; Liu et al., 2023; Lu et al., 2023; Ma et al., 2022; Wang et al., 2022; Yang et al., 2021; Zhang et al., 2022.

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究由黑龙江省自然科学基金资助（项目编号：PL2025C040）。

卢明秀|孙昊天|王振兴|王梓涵|刘琳琳|孙冰玉|黄宇阳|朱颖|曲敏|朱秀清