电子束诱导的结构改性增强了转谷氨酰胺酶-钙双重交联形成的豌豆蛋白乳化凝胶

《Food Chemistry》：Electron beam-induced structural modification enhances pea protein emulsion gels formed by transglutaminase?calcium dual crosslinking

　　

摘要
豌豆蛋白分离物（PPI）由于溶解性和凝胶化性能较差，在食品工业中的应用受到限制。本研究采用电子束辐照（EBI，5–30 kGy）处理PPI，随后与谷氨酰胺转氨酶（TG）和/或CaCl?进行双重交联，制备油包水乳化凝胶，旨在优化加工条件以改善凝胶化性能。适度的EBI辐照（10–15 kGy，其中15 kGy的综合改善效果最为显著）促进了蛋白质展开并增加了表面疏水性、水溶性（9.8%→11.2%）和乳化活性指数（15.9→25.6 m2/g）。双重交联（TG + 25 mM Ca2?）比单一交联产生了更强、更具弹性的网络结构，具有更高的持水性（80.7%）、更优的冻融稳定性和更高的粘弹性。EBI处理的PPI产生的凝胶质地较软但含水量更高。过量Ca2?（≥50 mM）或辐照（20–30 kGy）增加了蛋白质聚集并削弱了凝胶强度。这种物理-酶学交联组合策略可以根据特定食品应用定制植物基乳化凝胶。

引言
随着世界人口持续扩张，人们对可持续发展的关注日益增加，特别是在充足营养与肥胖缓解之间的平衡（Zhang, Zhang, et al., 2023）。因此，需要可持续且健康的功能性食品原料，用于配方下一代食品产品。豌豆蛋白分离物（PPI）已成为领先的植物基蛋白来源，得益于其高营养品质、储量丰富、生产成本经济、低致敏性、非转基因状态、均衡的氨基酸组成、易消化性、良好的可持续性和低环境影响（Shen, Hong, Singh, Koppel, & Li, 2022）。尽管具有这些优势，PPI与许多其他植物蛋白一样，也存在共同缺点，即溶解度低和凝胶化性能差，这限制了其在食品工业中的实际应用（Zha, Dong, Rao, & Chen, 2019）。因此，需要创新的修饰策略来提高PPI的功能性，从而拓宽其在食品和饮料产品中的潜在应用。

植物蛋白修饰技术采用物理、化学或生物处理来改变蛋白质的构象、聚集或表面化学性质，从而提高其功能性（Akharume, Aluko, & Adedeji, 2021）。物理方法，如热加工、高压、电离辐射和超声处理技术，可用于修饰蛋白质结构和聚集行为，同时避免化学残留问题（Wang et al., 2024）。电离辐射包括由放射性同位素（如??Co和13?Cs）产生的γ射线和由机器源产生的高能电子束，可用于修饰食品特性（Farkas, 2006）。尽管初始成本较高，但由于其高效率、低能耗和无污染运行，电子束辐照（EBI）仍可用于蛋白质修饰（Sui et al., 2025; Wang et al., 2019）。约有50个国家已批准食品辐照方法，这可能促进其商业化应用（Farkas, 2006）。作为一种非热技术，EBI保留了食品营养成分并避免了化学残留，同时修饰蛋白质结构以提高产品质量。电子束辐照引起的豌豆蛋白分离物的化学修饰可能包括氧化、脱酰胺、交联和裂解。氧化源于EBI对蛋白质侧链的直接攻击或由水辐照分解产生的自由基（Hinge, Dhole, Banpurkar, & Kulkarni, 2025; Zhang et al., 2020）。在干粉状态下，直接效应占主导，自由基优先攻击含硫和芳香族氨基酸，从而引发侧链氧化（Bai et al., 2024; Hinge et al., 2025）。脱酰胺针对天冬酰胺和谷氨酰胺残基，将其酰胺基团（CONH?）转化为羧基（COOH），引入负电荷并增强蛋白质-水相互作用和静电排斥。这被认为是辐照后溶解度增加的重要因素（Li et al., 2024; Shen et al., 2024; Zhang, Feng, et al., 2022）。交联表现为二硫键含量显著增加并促进了分子间聚集（Bai et al., 2024）。在干粉条件下，剂量范围为5至30 kGy时，裂解通常不会导致可检测到的肽键断裂（Bai et al., 2024; Li et al., 2024）；只有二硫键裂解可能发生。总体而言，这些修饰可能影响溶解性、乳化能力、起泡性能和凝胶化行为等关键功能特性。据Liu等人（2019）报道，EBI处理促进了球状鸡蛋清蛋白中疏水性氨基酸的表面可用性，这有助于其更强的抗氧化活性。Malik, Sharma, and Saini（2017）观察到，增加EBI剂量（0–50 kGy）逐渐减少了向日葵蛋白的α-螺旋含量，同时增加了β-折叠含量，这与其构象和聚集的变化一致。Wang等人（2019）证明，应用EBI（5–50 kGy）显著改善了豌豆蛋白水解物的功能性，乳化能力在50 kGy时达到峰值，起泡性能在10 kGy时最优。从安全性角度来看，10 kGy以下的剂量完全安全。然而，1999年世界卫生组织的评估报告指出，更高的剂量也可能被接受，前提是所应用的技术符合所需的剂量标准（Wang, Zhang, et al., 2017）。

乳化凝胶是一种复合胶体体系，其中油滴嵌入三维半固体基质中（Farjami & Madadlou, 2019）。乳化凝胶在一个系统中结合了乳液和凝胶的双重优势，提供了增强的动力学稳定性、可定制的质构特性、良好的包埋性能和可控释放能力（Farjami & Madadlou, 2019）。蛋白质通常既用作乳化剂又用作凝胶剂来制备乳化凝胶（Lin, Kelly, & Miao, 2020）。蛋白质的两亲性质使其能够在均质化过程中吸附到油滴表面，而其在适当条件下形成分子间交联的能力使其能够形成凝胶。分散在水包油乳液水相中的蛋白质交联导致凝胶填充型乳液的形成（Farjami & Madadlou, 2019）。这些类凝胶系统可用于创造创新的食品产品或改善传统产品的质构和感官属性，如冰淇淋、酸奶和肉类替代品（Geremias-Andrade, Souki, Moraes, & Pinho, 2016）。热加工和非热加工均可用于制备水相含有蛋白质基质的乳化凝胶（Zhang, Zhang, et al., 2023）。对于球状植物蛋白，可通过将体系加热至其热变性温度以上来诱导蛋白质展开和不可逆聚集，从而实现热凝胶化（Abaee, Mohammadian, & Jafari, 2017; Mao, Roos, & Miao, 2014）。然而，此过程可能导致热不稳定物质的降解。因此，冷凝胶化乳化凝胶更适合包埋这些热敏性化合物，可利用常见的交联剂如矿物质离子（如Ca2?）或酶（如谷氨酰胺转氨酶，TG）来形成（Cao & Mezzenga, 2020）。钙诱导的蛋白质凝胶化主要通过静电屏蔽和架桥效应发生，其中Ca2?离子在蛋白质上的阴离子基团之间形成盐桥（Ma, Xiong, & Jiang, 2022）。TG催化蛋白质分子内和分子间共价交联键的形成，从而发展出坚固耐用的蛋白质基质（Niu, Xia, Li, Wang, & Yu, 2019）。然而，传统的单交联凝胶往往功能性有限，因为过量的盐离子会破坏杂化网络，而高TG剂量可能降低凝胶的期望特性，如持水性（Huang, Shi, Ren, Hao, & Weng, 2022; Zhang et al., 2022）。为解决这些问题，可采用双交联策略制备蛋白质凝胶以扩展其应用范围（Graham, Marina, & Blencowe, 2019）。虽然本研究侧重于TGase/Ca2?诱导的蛋白质交联，但将多糖引入此类体系代表了未来研究的一个有前景的方向，特别是在调节凝胶特性和扩展食品蛋白质工程应用方面（Byeon, Kang, & Chang, 2023; Kuang et al., 2024）。

尽管EBI和Ca2?/TG交联各自具有优势，但它们对豌豆蛋白乳化凝胶的联合效应尚未被系统研究。在本研究中，我们研究了将EBI处理与单交联或双交联相结合以增强豌豆蛋白凝胶特性的潜力。此外，基于先前研究的实验数据，系统地评估了EBI在低剂量（5 kGy）、中剂量（10和15 kGy）和高剂量（20和30 kGy）下的影响。假设存在一个最佳辐照剂量，可以促进蛋白质结构变化而不过度引起蛋白质聚集。通过系统地分析辐射引起的蛋白质结构变化，我们确定了增强PPI理化性质和功能特性的最佳辐照剂量。然后利用该EBI修饰的PPI形成油包水乳液，并通过添加Ca2?和/或谷氨酰胺转氨酶将其冷凝胶化为单交联或双交联凝胶。本研究提供了重要的新见解，可用于创造具有改善质构特性和性能的创新功能性食品。

材料
本研究所用的豌豆蛋白分离物（PPI，纯度≥90%）购自西安泽龙生物科技有限公司（陕西，中国）。冰醋酸、甲醇、尿素、三氯乙酸和β-巯基乙醇购自天津致远化学试剂有限公司（天津，中国）。考马斯亮蓝R250由北京索莱宝科技有限公司提供（北京，中国）。8-苯胺ino-1-萘磺酸（ANS，分析级）购自阿拉丁。

扫描电子显微镜（SEM）用于观察EBI处理引起的PPI粉末的形态变化（图1）。天然PPI含有不同大小的不规则形状颗粒，表面相对光滑（图1a）。EBI处理后，在5 kGy剂量下检测到这些颗粒表面完整性的降低（图1b），显示出细微裂纹和轻微凹陷，而整体表面仍保持完整致密。随着EBI……

结论
总之，系统研究了电子束辐照剂量与谷氨酰胺转氨酶和/或Ca2?离子交联对豌豆蛋白乳化凝胶特性的综合影响。本研究的主要贡献在于经验性地优化了一种加工策略，将EBI诱导的结构修饰与双交联相结合以增强凝胶性能。研究结果表明，EBI照射改变了豌豆蛋白的结构，CRediT作者贡献声明

Yan Yin：撰写——初稿、方法论、形式分析、数据整理。Siqi Wang：撰写——初稿、可视化、验证、调查、数据整理。Jiangtao Yu：资源、方法论。Xiaohui Ma：可视化、调查、数据整理。David Julian McClements：撰写——审阅与编辑、可视化。Long Jin：调查。Cuicui Ma：可视化、调查。Xuebo Liu：监督。Fuguo Liu：撰写——审阅与编辑、可视化、监督。

利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

致谢
本研究由中国国家重点研发计划（项目编号：2024YFF1106600）资助。我们感谢西北农林科技大学食品科学与工程学院仪器共享平台和生命科学大型仪器共享平台提供的帮助。

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