《Food Chemistry: X》：Effects of ultrasonic pretreatment on the molecular conformation, gel texture, and rheological properties of oat-whey dual-protein gel induced by lactic acid bacteria fermentation
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基于植物-动物蛋白组合的新型发酵营养食品的开发，因双蛋白体系有限的凝胶形成能力和结构调控难题而仍具挑战。本研究探讨了在乳酸菌（LAB）发酵前对燕麦蛋白-乳清蛋白分散液进行超声预处理（0–600 W）对所得双蛋白凝胶（OWLG）凝胶及结构特性的影响。超声预处理以
基于植物-动物蛋白组合的新型发酵营养食品的开发，因双蛋白体系有限的凝胶形成能力和结构调控难题而仍具挑战。本研究探讨了在乳酸菌（LAB）发酵前对燕麦蛋白-乳清蛋白分散液进行超声预处理（0–600 W）对所得双蛋白凝胶（OWLG）凝胶及结构特性的影响。超声预处理以功率依赖方式调控蛋白聚集和凝胶网络形成。300 W预处理组表现出最小粒径（137.30 ± 1.46 nm）、最短凝胶化时间（5.0 ± 0.06 h），并改善了质构、持水性和流变行为。结构分析表明，300 W超声预处理促进了蛋白质重排，使β-折叠含量增加至48.36 ± 0.16%，并形成最致密、最稳定的凝胶网络。本研究为调控谷物-动物蛋白发酵凝胶及开发功能性发酵营养食品提供了一种有前景的策略。
论文解读：超声预处理对乳酸菌发酵燕麦-乳清双蛋白凝胶分子构象、质构及流变特性的影响
1. 研究背景与亟待解决的问题
随着全球人口增长和可持续蛋白源需求的不断提升，植物-动物蛋白复合体系已成为食品工业的重要研发方向。燕麦蛋白（OP）作为一种低成本、广泛种植的植物蛋白来源，具有蛋白质含量高、消化性好、无麸质且低致敏性等优点，但其氨基酸组成不平衡，单独应用难以满足全面营养需求。乳清蛋白（WP）作为代表性动物蛋白，具有优良的溶解性、凝胶性和高营养价值，近年来成为植物蛋白复配体系中的理想搭档。然而，现有研究多集中于豆科蛋白-乳清蛋白体系的凝胶特性，而对谷物蛋白-乳清蛋白体系，尤其是燕麦蛋白-乳清蛋白体系的结构特征、分子间相互作用及凝胶行为仍缺乏系统探索。此外，乳酸菌（LAB）发酵虽在单一蛋白凝胶体系中表现出显著优势，但在双蛋白凝胶制备中的工艺调控和增强机制研究仍十分有限。蛋白质间的结构差异可能导致弱相互作用，使双蛋白凝胶质构较差。超声预处理作为一种环境友好且高效的蛋白修饰技术，已广泛用于改善蛋白凝胶性质，但其对LAB发酵诱导的谷物蛋白-乳清蛋白凝胶的影响尚不明确，尤其是超声调控蛋白分子构象、分子间相互作用、发酵行为与最终凝胶特性之间的关系有待阐明。因此，本研究旨在探讨不同超声功率预处理对LAB诱导OP-WP凝胶体系理化、质构和流变特性的影响，并通过结构表征技术阐明凝胶形成机制。
2. 研究内容与主要技术方法
研究人员以OP和WP为原料，经前期筛选确定最优OP-WP比例为1:4，蛋白浓度12%（w/v）。将复合蛋白溶液分别经0、100、200、300、400、500、600 W超声预处理（脉冲模式2 s开/2 s关，频率20 kHz，冰水浴20 min），随后添加蔗糖并灭菌，冷却至43 °C后接种乳酸菌（MV040），于43 °C恒温发酵8 h制得LAB诱导OP-WP双蛋白凝胶（OWLG）。研究采用了多种技术手段：利用分子对接（GRAMM服务器、PyMOL软件）预测OP与WP的潜在相互作用；采用粒径分析仪测定平均粒径和多分散指数（PDI）；通过Ellman试剂法测定游离巯基（FSH）和二硫键（SS）含量；采用ANS荧光探针测定表面疏水性（H0）；监测发酵过程中pH变化并记录凝胶形成时间；使用质构仪进行TPA测试；通过离心法测定持水性（WHC）；利用低场核磁共振（LF-NMR）分析水分分布；使用旋转流变仪进行粘度测量、频率扫描、大振幅振荡剪切（LAOS）和蠕变恢复测试；采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析蛋白质二级结构；利用扫描电子显微镜（SEM）观察凝胶微观结构；最后通过Pearson相关分析和主成分分析（PCA）揭示各指标间关系。
3. 主要研究结果
3.1 分子对接
分子 docking 预测显示OP与WP之间的结合能为-709.11 kcal/mol，表明蛋白质间存在优异的相互作用。OP（Q38779）与WP（3NPO）之间可通过GLY43、THR439、ARG148、SER150、GLU509等氨基酸残基形成7个氢键，并在GLU134-LYS527、ARG148-GLU509、ASP33-ARG504之间形成盐桥。这些分子间作用力构成了OWLG的基本框架，有助于维持凝胶稳定性。然而，分子对接本质上是理想化条件下的静态模拟，无法完全反映超声和发酵过程中的动态构象变化，因此需后续实验验证。
3.2 粒径与PDI
随着超声功率从0 W增至300 W，OWLG平均粒径从221.33 ± 0.98 nm降至137.30 ± 1.46 nm，PDI值降低19.52%。超声空化效应加速了不稳定大分子聚集体的解聚。但当功率超过300 W时，过度破坏导致活性基团过度暴露，蛋白分子重新聚集，粒径反而增大。300 W预处理下O WLG聚集体表现出更小粒径和更稳定的结构。
3.3 巯基含量与表面疏水性
超声预处理显著降低了OWLG中FSH含量，但不同功率间差异不显著。SS含量随超声功率增加先升后降，300 W时达到最大值1.01 ± 0.02 μmol/g。超声暴露巯基并在热变性条件下促进FSH氧化转化为SS键。超过300 W时过度破坏力使已有SS键断裂，并促进分子重新聚集，减少了新SS键生成。H0随超声功率增加呈显著下降趋势，从142.6 ± 2.27降至58.81 ± 0.42（300 W）。SS键形成促进蛋白交联和重聚，将疏水结合位点包裹在凝胶基质中，导致表面疏水性降低。
3.4 pH与凝胶时间
所有样品初始pH约6.5，随发酵时间延长逐渐降至4.2附近。超声预处理加速了pH下降，并显著缩短凝胶形成时间。300 W时凝胶形成时间最短，为5.0 ± 0.06 h。超声预处理通过破坏蛋白聚集体、暴露反应位点，促进LAB对OP-WP体系的降解，加速乳酸产生和H?浓度升高，从而提高发酵效率。
3.5 质构特性
在0–300 W范围内，OWLG的硬度、弹性和咀嚼性显著提高，内聚性无显著变化。300 W时硬度达21.39 ± 0.25 g，弹性0.66 ± 0.01，咀嚼性6.98 ± 0.32。适度超声使大分子聚集体解聚，增强蛋白质与水分子的有效相互作用，同时SS键形成促使小分子蛋白间形成紧密交联网络。但超过400 W后，过度暴露疏水基团导致表面水化层形成，蛋白质分子间结构变得无序松散，形成不溶性聚集体，质构指标下降。
3.6 持水性与水分分布
超声预处理显著增强OWLG的WHC，从36.74%（0 W）升至54.85%（400 W），但300 W与400 W组间无显著差异。超声使蛋白展开、粒径减小，增大蛋白与水接触面积，同时H0降低表明蛋白与水分子结合更紧密。超过400 W后蛋白颗粒聚集破坏连续凝胶网络，WHC下降。LF-NMR分析显示OWLG中存在三种水分：T21（强结合水）、T22（中等结合水）和T23（自由水）。超声预处理显著缩短T22弛豫时间并增大其峰面积比例。300 W时PT22达79.06%，PT23降至1.16%，表明凝胶对水分子的结合能力最强。超声诱导蛋白变性暴露更多水结合位点，促进二硫键形成，增强蛋白交联，将更多水固定于凝胶基质中。
3.7 流变特性
所有OWLG样品呈现典型剪切稀化行为。超声预处理显著增加初始粘度，从37.05 Pa·s（0 W）升至111.95 Pa·s（300 W），这归因于粒径减小提高可溶性物质含量，增大LAB与蛋白接触面积，促进酸性条件下蛋白聚集。频率扫描显示所有样品G′均大于G″，呈现典型黏弹材料特征。超声预处理显著提高G′和G″，400 W时最高，但过高功率破坏凝胶结构导致下降。应变扫描显示超声预处理使线性黏弹区（LVR）变窄且临界应变降低，表明凝胶硬度增加、脆性增大、变形耐受性减弱。蠕变恢复测试表明300 W时应变最低、恢复率最高（61.34 ± 1.14%），说明适度超声可增强凝胶抗外力能力和变形恢复能力。综合流变评价显示300 W组综合流变性能最优，在机械强度与应变耐受间达到最佳平衡。
3.8 二级结构
FTIR结果显示超声预处理未产生新吸收峰，说明未破坏或形成新官能团。3000–3500 cm?1处OH伸缩振动强度随超声功率增加先增后减，300 W时最强，表明超声空化效应增加亲水基团暴露并促进OP和WP间氢键形成。二级结构分析表明超声处理增加β-折叠和β-转角含量，α-螺旋含量从17.48 ± 0.24%（0 W）降至13.94 ± 0.22%（300 W），无规卷曲含量显著减少。α-螺旋向β-折叠的转化源于超声破坏分子内氢键后形成新的分子间氢键。无规卷曲含量减少表明凝胶网络密度增加，硬度提升而柔韧性下降，与质构和应变扫描结果一致。但功率过高时蛋白重新聚集为大颗粒无规卷曲结构，凝胶网络变得松散。
3.9 微观结构
SEM观察显示所有OWLG样品在1000×放大倍数下均呈现连续三维网络骨架。未超声处理组凝胶表面存在大量不规则孔洞和树枝状突起，为不规则大分子颗粒聚集所致。200 W和300 W处理组表面孔洞较小且分布均匀，不规则突起消失，表面更光滑，这与SS和β-折叠含量增加促进分子间交联有关。功率进一步增加后，凝胶网络重新变得松散不规则，孔径增大，导致质构松散、抗变形能力下降。
3.10 相关性与主成分分析
Pearson相关分析显示OWLG聚集体粒径、SS含量、β-折叠含量与凝胶弹性显著负相关。β-折叠含量与H0和凝胶形成时间显著负相关，与凝胶硬度、弹性和持水性正相关，说明二级结构对凝胶品质起决定性作用。PCA分析表明第一主成分贡献78.7%方差，前两个主成分累计解释88.3%方差。聚集体粒径、β-折叠含量和SS键含量是驱动凝胶性质差异的核心因素。
4. 讨论与结论
研究人员将超声预处理与LAB发酵相结合成功制备了OWLG双蛋白凝胶，丰富了双蛋白凝胶种类，填补了谷物蛋白与乳清蛋白相互作用机制研究的空白。适度超声预处理能够破坏不规则蛋白聚集、减小粒径和PDI、充分暴露内部巯基残基并通过自由基氧化促进SS键形成，增强分子间交联；同时暴露的疏水基团加强分子间疏水相互作用。这种协同效应加速凝胶网络形成，缩短发酵时间；解聚作用促使蛋白分子有序重排，α-螺旋和无规卷曲含量降低表明较松散分子内结构被致密结构取代，增强了凝胶机械强度和黏弹性。但过高的超声功率会削弱凝胶质构改善效果，降低凝胶质量，并因硬度过高和柔性结构丧失而减弱抗变形能力。虽然该特性限制了其在常规发酵凝胶食品中的应用，但为开发适合吞咽障碍患者的特需食品提供了差异化技术途径。Pearson相关分析和PCA进一步确认聚集体粒径、β-折叠含量和SS键含量是驱动OWLG品质变化的主要因素。该技术的合理应用可显著缩短酸奶、奶酪等发酵凝胶食品的生产周期，优化产品质构，增强储运稳定性。未来研究应进一步优化超声处理参数和发酵条件，系统探索OWLG的营养转化、胃肠道消化行为及生物活性化合物释放机制，并关注OWLG作为生物活性肽和亲脂性营养素包埋递送功能凝胶基质的潜力。
