山茶（Camellia japonica）种子中天然存在的合成苦味剂——地那铵（Denatonium）的发现与定量分析

《Food Chemistry: X》：Denatonium in Camellia japonica seeds: A synthetic bitterant found in nature

　　

摘要专业翻译 苦味是一种重要的感官线索，使动物能够避免摄入潜在有毒或有害物质。苦味感知与食物源中有害或防御性化学物质的检测密切相关，并能强烈影响摄食行为和生存（Wooding, Ramirez, & Behrens, 2021）。许多植物产生苦味次生代谢物，包括生物碱、皂苷、酚类化合物、萜类和糖苷，作为抵御草食动物、昆虫和微生物攻击的化学防御手段。种子是化学保护的重要目标，因为它们含有胚组织和下一代所需的营养储备。这一观点与植物防御及种子/果实毒性的普遍概念一致，即特化代谢物可以保护有价值的繁殖组织免受草食动物和捕食者的侵害（Beckman, 2013; War et al., 2012）。 特别是，C. japonica 种子已被报道含有三萜皂苷和抗氧化植物化学物质，包括山茶皂苷（camelliasaponins）和酚类抗氧化剂（Saenjum, Pattananandecha, & Nakagawa, 2020; Yoshikawa et al., 1994）。这些化合物连同皂苷和多酚，通常被认为可能是山茶种子和种子饼苦味或涩味的贡献者。然而，咀嚼 C. japonica 种子时感知到的异常强烈苦味似乎比普通植物苦味更强且更持久，提示存在额外的强效苦味成分。 地那铵（Denatonium）被广泛认为是苦味最强的化合物之一，常用作合成苦味剂，以防止意外摄入有毒或不良产品。地那铵盐被用作厌恶剂，用于变性酒精、家用化学品及其他不应摄入的材料中（Lege, Guillet, Merel, Yanez Heras, & Zwiener, 2017）。人类和动物研究也表明，苯甲酸地那铵（denatonium benzoate）可产生强烈的味觉厌恶并减少对处理液体的摄入（Berning, Griffith, & Wild, 1982; Gibbs et al., 2022）。由于地那铵主要被视为合成苦味剂而非天然植物代谢物，其在植物组织中的检测将是出乎意料且具有科学意义的。 在对 C. japonica 种子进行分析过程中，研究人员观察到直接咀嚼种子会产生异常强烈的苦味，区别于常见植物代谢物引起的典型苦味。这一观察促使研究人员调查种子中是否存在高效苦味化合物。在本研究中，成熟的 C. japonica 种子在粗分解花岗岩或新西兰泥炭藓中萌发，所得幼苗被解剖为胚根、胚芽和子叶。这些组织连同脱油后获得的种子饼，通过 LC-MS/MS 进行分析。使用苯甲酸地那铵作为标准品，研究人员在多个种子衍生组织中鉴定出地那铵，并定量了其在子叶和种子饼中的丰度。 本研究报道了地那铵在 C. japonica 种子和萌发种子组织中的天然存在。该发现表明，地那铵可能是导致 C. japonica 种子异常苦味的主要苦味成分，并可能在种子发育和萌发过程中发挥化学防御因子的作用。

论文解读

一、研究背景与问题提出

苦味是动物避免摄入潜在有毒或有害物质的重要感官线索，与食物源中有害或防御性化学物质的检测密切相关。许多植物通过产生苦味次生代谢物，包括生物碱、皂苷、酚类化合物、萜类和糖苷等，作为抵御草食动物、昆虫和微生物攻击的化学防御手段。种子作为含有胚组织和营养储备的繁殖结构，是化学保护的重要目标。

山茶（Camellia japonica）种子此前已被报道含有三萜皂苷和抗氧化植物化学物质，如山茶皂苷和酚类抗氧化剂，这些化合物连同皂苷和多酚通常被认为可能是山茶种子和种子饼苦味或涩味的贡献者。然而，研究人员在分析过程中观察到，直接咀嚼 C. japonica 种子产生的苦味异常强烈且持久，明显区别于普通植物代谢物引起的典型苦味。这种超常的苦味强度提示种子中可能存在额外的强效苦味成分。

地那铵（Denatonium）被公认为苦味最强的化合物之一，通常被用作合成苦味剂，添加于变性酒精、家用化学品等不应被摄入的产品中以防止意外误食。由于地那铵长期被视为合成化合物而非天然植物代谢物，其在植物组织中的检测将是出乎意料且具有重要科学意义的发现。基于上述观察和背景，研究人员开展了本研究，旨在探究 C. japonica 种子异常强烈苦味的化学基础。

二、研究内容与主要结论

研究人员将成熟的 C. japonica 种子在粗分解花岗岩或新西兰泥炭藓基质中萌发，将萌发幼苗解剖为胚根、胚芽和子叶三个解剖部位，并获取脱油后的种子饼样品。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，使用苯甲酸地那铵作为标准品，研究人员在多个种子衍生组织中鉴定出地那铵，并通过定量分析确定了其在子叶和种子饼中的含量。研究结果表明，地那铵在子叶中的含量约为3 g/kg干重，在种子饼中约为2 g/kg干重，子叶中的含量显著高于种子饼。该发现证实地那铵是 C. japonica 种子中大量存在的苦味成分，而非痕量污染物。

这一发现具有重要意义。首先，地那铵此前主要被视为合成苦味剂，其在天然植物来源中的大量存在拓展了对该化合物的认知。此前仅在白芸豆（Phaseolus multiflorus var. albus）中报道过地那铵的天然存在，但该研究中地那铵的分离量仅为每公斤植物材料2.3 mg，未被视为主要苦味成分。相比之下，C. japonica 种子中地那铵的含量达到g/kg级别，表明其是该种子中主要的苦味成分。其次，地那铵的组织分布特征提示其可能作为种子特异性化学防御因子，保护高营养价值的繁殖组织免受捕食。研究还发现，地那铵在脱油后的种子饼中仍大量保留，表明山茶种子饼可作为天然含地那铵的非油性材料，具有潜在的工业应用价值。

三、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：种子萌发与组织解剖方法，将成熟 C. japonica 种子在粗分解花岗岩或新西兰泥炭藓基质中于韩国冬季条件下萌发至次年三月下旬，收获后解剖分离胚根、胚芽和子叶；脱脂种子饼样品由韩国统营市山茶研究所提供；样品经80%乙醇超声提取、减压浓缩后制备分析溶液；采用高分辨质谱Orbitrap Exploris 120结合液相色谱系统进行LC-MS/MS分析，通过保留时间、母离子和诊断碎片离子与苯甲酸地那铵标准品比对确认地那铵身份；采用UPLC-QTRAP 4500质谱系统以多反应监测（MRM）模式进行定量分析，监测母离子m/z 325.27及其三个MRM跃迁。此外，还采用GNPS分子网络进行非靶向MS/MS分析作为独立验证。

四、研究结果

4.1 种子萌发与组织解剖。 成熟 C. japonica 种子萌发后，胚根从种子体伸长，胚芽从萌发种子上部区域出现。研究人员根据幼苗形态将萌发种子分为胚芽、子叶和胚根三个主要解剖区域，为后续确定地那铵的组织分布奠定了基础。

4.2 胚芽和胚根组织中地那铵的检测。 通过LC-MS/MS分析，胚芽和胚根组织的总离子流色谱图（TIC）均在约5.73–5.74 min处出现显著峰，提取离子流色谱图（XIC）在相同保留时间显示清晰峰。MS1谱图显示m/z 325.2272的母离子，MS2碎裂产生m/z 86.0965、91.0543、148.1121和233.1650的诊断碎片离子，与地那铵阳离子特征一致。GNPS分子网络分析也独立注释了该特征为地那铵。以上结果确认地那铵存在于萌发种子衍生的胚芽和胚根组织中。

4.3 地那铵标准品、子叶提取物和种子饼提取物的比较。 在相同LC-MS/MS条件下分析苯甲酸地那铵标准品、子叶提取物和种子饼提取物，三者TIC均在约5.50–5.63 min处出现共同显著峰，XIC分析在相同保留时间显示对应峰。MS1谱图均显示m/z 325.227的地那铵阳离子，MS2谱图均产生m/z 86.096、91.054、148.112和233.165的诊断碎片离子。保留时间、母离子和碎裂模式的一致性确认了子叶和种子饼样品中检测到的化合物为地那铵。

4.4 子叶和种子饼中地那铵的定量测定。 定量LC-MS/MS分析显示，地那铵在子叶中的含量约为3 g/kg干重，在种子饼中约为2 g/kg干重，子叶中的地那铵水平显著高于种子饼。该结果表明地那铵内在积累于种子组织中，并在脱油后保留于非油性部分。

4.5 地那铵在 C. japonica 种子衍生组织中的天然存在及其意义。 地那铵在胚芽、胚根、子叶和种子饼中均被检测到，但在成熟大树根提取物中未检出，表明其并非广泛存在的组成性代谢物，而是与种子和早期萌发密切相关的组织特异性成分。子叶中较高的地那铵含量提示其内在积累于种子组织而非萌发过程中新产生。种子饼中2 g/kg干重的含量表明脱油过程仅造成部分损失。该组织分布特征符合最优防御理论，即防御性代谢物优先分配至高适应价值组织。由于地那铵是已知苦味最强的化合物之一，其在种子中的大量积累可作为强效摄食威慑物，降低种子被捕食的可能性。

五、讨论总结与结论

讨论部分指出，地那铵此前主要被视为合成苦味剂，其在 C. japonica 种子中的大量存在为天然植物来源中该化合物的存在提供了新的例证。与白芸豆中地那铵的痕量分离不同，C. japonica 种子中地那铵达到g/kg级别，表明其是主要的苦味成分而非痕量污染物。地那铵的阳离子和非脂质特性使其在脱油后保留于种子饼中，这解释了种子饼中仍检测到大量地那铵的现象。研究还指出，未成熟胚组织几乎无苦味，而成熟种子呈现极强苦味，提示地那铵的积累可能随种子成熟而增加。地那铵在高等植物中的生物合成途径尚不清楚，需要结合同位素示踪、转录组学和代谢组学分析进一步阐明。含地那铵的山茶种子饼可能具有作为天然苦味材料、动物摄食威慑剂、化妆品成分或工业苦味剂的潜在应用价值，但实际应用需要谨慎的标准化和安全性评估。

研究结论为：C. japonica 种子含有大量地那铵，尽管该化合物此前主要被视为合成苦味剂。其在胚芽、胚根、子叶和脱脂种子饼等多个种子衍生组织中的检测，以及使用标准品的确认，支持其作为可重现的种子相关成分而非分析假象。子叶和种子饼中g/kg级别的丰度表明地那铵是主要的苦味成分而非痕量污染物。这些发现为 C. japonica 种子的异常强烈苦味提供了化学基础，并提示地那铵可能参与了此前未被识别的种子相关防御系统。地那铵在脱脂种子饼中的保留进一步表明山茶种子饼是天然含地那铵的非油性部分。在适当的标准化、纯化和安全性评估后，来自山茶种子饼的天然地那铵可为更安全、更可持续的工业应用提供苦味材料的替代来源。