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《Environment International》：Association between per- and polyfluoroalkyl substances exposure and recurrent pregnancy loss: The potential role of oxidative stress and the HIF1α?GLUT1/VEGFA axis

　　

复发性流产（recurrent pregnancy loss, RPL）是一种影响全球育龄女性的常见生殖障碍疾病，且相当比例的病例为病因不明的特发性RPL。全氟及多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances, PFAS）是环境中广泛存在的持久性有机污染物，具有潜在的生殖毒性；然而，PFAS暴露与RPL之间的关联及其潜在机制至今仍认识不足。本研究旨在探讨PFAS暴露与RPL风险之间的独立关联，并探索氧化应激及HIF1α-GLUT1/VEGFA信号轴在PFAS相关生殖损害中的潜在中介作用。研究采用多层次设计，包括一项纳入50名RPL患者和100名健康对照的病例对照研究、体内小鼠暴露实验及体外细胞功能实验。研究人员采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定血清PFAS水平，并进行多组学分析以筛选候选病理通路。雌性小鼠经饮水暴露于全氟辛酸（perfluorooctanoic acid, PFOA）或全氟戊酸（perfluoropentanoic acid, PFPeA），评估其生殖结局、组织病理学及通路表达变化。研究人员使用人生殖细胞系进行PFAS处理，并开展N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）救援实验以验证氧化应激的上游作用。临床结果显示，RPL患者血清中多种长链PFAS浓度显著升高，且在调整混杂因素后，PFAS暴露与RPL风险增加独立相关。非靶向血清代谢组学和探索性子宫内膜蛋白质组学鉴定出RPL相关的糖酵解及HIF-1α/VEGF信号通路紊乱，这些RPL相关特征随后被作为机制假说，在后续动物及细胞模型中进行PFAS因果作用的验证。动物实验表明，长链PFOA暴露可扰乱动情周期、降低妊娠率并增加胚胎吸收，同时伴随生殖组织中HIF1α、GLUT1和VEGFA表达的失调。体外细胞实验一致证明，PFOA处理可抑制细胞活力、促进细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）过度产生、损害滋养层细胞迁移和内皮细胞血管生成，并扰乱HIF1α-GLUT1/VEGFA轴。平行进行的短链PFPeA实验提供了体内和体外模型的探索性比较毒性数据。在HTR-8/SVneo细胞中，NAC预处理可部分减轻PFAS诱导的细胞内ROS积累和细胞活力丧失，支持氧化应激作为PFAS相关细胞毒性的潜在上游介质。然而，NAC救援实验未评估HIF1α轴失调及功能损害（迁移/血管生成）的逆转情况。总之，血清PFAS暴露与RPL风险升高独立且稳健相关。氧化应激介导的HIF1α-GLUT1/VEGFA轴失调可能是PFAS相关生殖功能障碍及不良妊娠结局的基础。这些发现为普遍存在的PFAS暴露的生殖健康风险提供了支持性证据，并为特发性RPL的病因学研究提供了初步的机制线索。

### 论文解读文章

#### 研究背景与问题

复发性流产（recurrent pregnancy loss, RPL）定义为连续两次或以上的临床妊娠失败，是影响全球约5%至10%育龄女性的常见生殖健康问题，不仅损害患者身心健康，还带来沉重的情感与家庭负担。尽管已有大量研究确认了包括遗传异常、内分泌紊乱、免疫功能障碍和子宫结构畸形在内的多种已知风险因素，但仍有高达30%至40%的RPL病例病因不明，提示可能存在的环境暴露因素在RPL发病机制中扮演着未被充分认识的重要角色。全氟及多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances, PFAS）是一类具有高热稳定性和化学稳定性、疏水疏油特性的人工合成持久性有机污染物，自20世纪中期以来被广泛用于工业制造、消费品、食品包装及消防泡沫等领域。凭借其极端的环境持久性和生物蓄积性，PFAS已在全球范围内的饮用水、土壤、空气及生物组织中普遍检出，成为威胁人类健康的全球性环境污染物。近年来，PFAS的生殖毒性备受关注。流行病学研究表明，PFAS暴露与自然流产、早产、胎儿生长受限等不良妊娠结局密切相关，但PFAS暴露与RPL之间的特定关联及其分子机制仍未阐明，亟需系统性、多层次的研究加以验证。缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α, HIF1α）是调控细胞低氧适应、能量代谢和血管生成的核心转录因子，其下游靶基因葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1, GLUT1）和血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGFA）分别参与调控细胞糖酵解和血管生成。既往体外研究已证明PFAS暴露可干扰细胞内氧平衡，导致体细胞中HIF1α的异常稳定和积累；同时，PFAS相关氧化应激可调控HIF1α的翻译后修饰，从而可能干扰其下游GLUT1和VEGFA基因的转录活性。HIF1α-GLUT1/VEGFA轴的正常表达对于卵泡发育、子宫内膜容受性建立、胎盘形成和胚胎着床至关重要，该轴失调可能参与生殖功能障碍及不良妊娠结局。然而，氧化应激是否通过调控HIF1α-GLUT1/VEGFA轴参与PFAS相关RPL尚未见报道。在此背景下，本研究采用"人群队列-动物实验-细胞实验"的多层次研究设计，旨在明确PFAS暴露与RPL的关联，探索PFAS相关生殖损害的潜在分子机制，并阐明PFAS生殖毒性的剂量-效应关系及细胞特异性，为PFAS暴露相关生殖损害的防控和RPL的病因学研究提供新的实验证据和理论支撑。

#### 研究设计与方法

研究人员开展了一项连续入组的病例对照研究，招募2019年至2022年间来自兰州大学第二医院生殖医学科的150名育龄女性，其中RPL病例组50名，健康对照组100名。所有研究对象均采集外周血和子宫内膜组织样本，运用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测25种PFAS同系物；采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用平台（UHPLC-HRMS）开展非靶向血清代谢组学分析，同时基于数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）的蛋白质组学技术对5对RPL病例与对照的子宫内膜组织进行探索性蛋白质组学检测。在动物实验中，研究人员将6至8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为5组（每组12只），分别经饮水暴露于PFOA（低剂量1 mg/kg/day，高剂量5 mg/kg/day）或PFPeA（同剂量），连续暴露28天后与雄鼠合笼交配，并于妊娠第18天评估妊娠结局和组织病理学改变。体外实验中，研究人员使用人滋养层细胞系HTR-8/SVneo、人子宫内膜基质细胞系T-HESC、人卵巢颗粒细胞系KGN和人脐静脉内皮细胞系HUVEC等细胞模型，通过细胞活力检测、活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平测定、凋亡分析、迁移实验、血管生成实验及Western blot和qPCR等方法，验证PFAS的细胞毒性和信号通路调控作用，并利用N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）进行ROS救援实验。此外，还进行了分子对接以预测PFAS与靶蛋白之间的潜在相互作用。统计分析采用R 4.2.0和GraphPad Prism 8.0，运用多变量逻辑回归、倾向性评分匹配（propensity score matching, PSM）、逆概率加权（inverse probability weighting, IPW）、加权分位数和（weighted quantile sum, WQS）回归及岭回归等方法来评估PFAS暴露与RPL的独立关联和混合效应。

#### 研究结果

**PFAS暴露与RPL风险的关联**：病例对照研究显示，RPL患者血清中多种长链和中链PFAS（包括PFOA、PFOS、PFNA、PFHxS）的中位浓度显著高于对照组。多变量逻辑回归分析在校正年龄、BMI和教育水平后，发现PFOA、PFNA、PFOS和PFHxS与RPL风险增加独立相关，且在校正更多潜在混杂因素的扩展模型（进一步校正孕次、产次、月经周期长度、血压和腰臀比）中关联依然稳健。多种敏感性分析（PSM、IPW和分层分析）均证实了关联的稳健性，例如PSM匹配队列中PFOA的OR值为74.83（95%CI: 6.38-878.32, FDR = 0.0015）。WQS回归分析表明PFAS混合物整体暴露与RPL风险显著正相关（每增加四分位数OR = 16.30, 95%CI: 6.23-42.67, P < 0.001），PFNA、PFOA和PFOS为主要贡献因子。

**多组学分析鉴定RPL相关病理通路**：血清非靶向代谢组学分析在RPL组和对照组间鉴定出48种差异丰度代谢物（differentially abundant metabolites, DAMs），通路富集分析显示糖酵解/糖异生、氨基酸代谢和脂肪酸代谢通路显著扰动（图3A）。子宫内膜蛋白质组学分析鉴定出127个差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs），基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示这些DEPs主要涉及氧化应激反应、低氧应答、糖酵解过程和血管生成正调控（图4D）；KEGG通路富集显著富集于HIF-1和VEGF信号通路（图4E）；蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络提示HIF1α、GLUT1和VEGFA是核心枢纽蛋白（图4F）。上述RPL相关代谢和蛋白特征被确定为候选机制假说。

**动物实验验证PFAS生殖毒性及HIF1α轴失调**：高剂量PFOA和PFPeA暴露显著抑制小鼠体重增长，扰乱动情周期规律性（正常周期比例降至33.3%和25.0% vs 对照组83.3%），降低妊娠率并增加胚胎吸收（图5D-E）。PFOA和PFPeA均可穿越胎盘屏障，并在胎盘组织中蓄积（图5C）。组织学检查显示高剂量PFAS暴露导致卵巢中窦卵泡减少（约40%）、闭锁卵泡增加（近2倍）及黄体发育不良，同时子宫内膜变薄、腺体减少和基质细胞增殖减弱（图6）。Western blot和qPCR一致显示，高剂量PFAS暴露显著上调卵巢和子宫组织中核HIF1α蛋白及mRNA表达，而GLUT1和VEGFA的表达则呈剂量依赖性下调（图7）。

**体外细胞实验验证细胞毒性与功能损害**：PFOA和PFPeA在滋养层细胞HTR-8/SVneo、子宫内膜基质细胞T-HESC和颗粒细胞KGN中均呈剂量依赖性细胞毒性（图9A-C），以HTR-8/SVneo最为敏感。PFAS处理显著增加细胞内ROS水平（图9E），上调核HIF1α蛋白和mRNA表达，同时下调GLUT1和VEGFA的表达（图10），形成HIF1α积累与下游信号抑制的解偶联模式。功能实验显示，PFAS暴露显著抑制滋养层细胞迁移能力（24小时伤口愈合率降低约40-50%）（图11A-C）和HUVECs的管形成能力（节点数、主连接点和分支数显著减少）（图11D-G），且受PFAS处理条件培养基可进一步抑制HUVEC管形成。在NAC救援实验中，5 mM NAC预处理可将PFOA诱导的ROS积累从对照组的约2.7倍降至约1.5倍，并将细胞活力从对照组的约60%恢复至约80%（图12），支持氧化应激在PFAS细胞毒性中的上游作用。

#### 讨论与结论

讨论部分首先强调本研究的流行病学发现支持PFAS是RPL的既往未被充分认识的环境风险因素。针对病例组与对照组基线特征差异（年龄、BMI等）导致的潜在偏倚，研究人员运用多变量调整、PSM、IPW和分层分析等多种互补统计策略，均获得了一致结果，增强了关联的稳健性与可信度。该发现进一步提示，临床评估不明原因RPL时，有必要考虑PFAS暴露的评估。就PFAS暴露评估的混杂问题，研究人员专门讨论并否定了哺乳排泄导致对照组PFAS水平人为偏低的选择偏倚学说。本研究选择PFOA作为长链PFAS的代表进行机制验证，选择PFPeA作为短链替代物的探索性危害表征。关于多组学发现的HIF1α与下游靶基因GLUT1和VEGFA表达解偶联这一非经典现象，研究人员基于蛋白质组数据和已有文献提出了一个假说模型，即PFAS诱导的氧化应激通过抑制HIF1α泛素化降解导致其核内积累，同时氧化应激下调HIF1α必需结合伴侣ARNT（HIF1β）和转录共激活因子p300，从而使积累的HIF1α转录活性受损，最终导致下游靶基因表达降低。需要指出的是，ARNT和p300的下调目前仅在人子宫内膜蛋白质组学中被观察到，尚未在动物和细胞模型中得到验证，此转录解偶联机制属于待验证的假说。研究人员坦诚地指出了本研究的多项局限性，包括为单中心病例对照设计、缺乏暴露前瞻性时序、子宫内膜蛋白质组学样本量较小、实验剂量高于实际环境暴露水平、NAC缺乏通路特异性等，并指出了未来多中心前瞻性队列及靶向基因操控实验的研究方向。结论部分明确指出，PFAS暴露独立且稳健地与RPL风险增加相关，氧化应激介导的HIF1α-GLUT1/VEGFA轴转录失调是PFAS相关生殖功能障碍和妊娠失败的关键潜在机制，这些发现为RPL病因学提供了新的见解，并支持制定减少PFAS相关生殖健康风险的策略。

综上，本研究采用多层次研究设计，系统验证了PFAS暴露与RPL风险的独立关联，并首次提出氧化应激介导的HIF1α-GLUT1/VEGFA轴转录解偶联作为PFAS生殖毒性的潜在关键机制，为RPL的环境病因学研究和PFAS生殖健康风险防控提供了重要的科学依据。