DEFT：一种用于肠道细菌黏蛋白O-聚糖降解酶分类的快速结构搜索方法

《PLOS Computational Biology》：Fast structural search for classification of gut bacterial mucin O-glycan degrading enzymes

　　

酶学委员会（Enzyme Commission, EC）编号方案提供了一种根据酶催化功能对其进行层级分类的方法。尽管近年来基于蛋白质语言模型（protein language model, PLM）的方法（如CLEAN和ProteInfer）改进了基于序列的EC编号预测，但这些方法在最深层级上的精细分类仍存在困难。基于结构的方法利用比对工具对相似蛋白质进行分组，擅长发现具有整体全局结构相似的蛋白质，但在对整体结构相似而功能分化依赖于局部区域的蛋白质进行分类时，具有较高的假阳性率。这一问题与EC编号预测尤为相关，因为酶功能取决于其催化结构域，而催化结构域是蛋白质中一个相对较小且特异的区域。研究人员引入了深度酶功能转移（Deep Enzyme Function Transfer, DEFT），该方法通过一个关键见解协调了基于序列和基于结构的方法，即：基于PLM对EC编号层级前两级的注释可大幅减少纯结构方法预测EC编号时可能出现的假阳性。对于给定的目标酶，DEFT首先使用基于PLM的方法分配该酶EC编号的前两级，然后使用基于结构的方法预测EC编号的剩余两级。通过基准数据集，研究人员证明DEFT在EC编号预测方面优于当前最先进的工具。此外，研究人员还表明DEFT的计算效率使其能够对生物体的总酶库进行高通量、全基因组的注释。研究人员通过实验验证了DEFT预测的肠道黏液相关细菌的糖苷水解酶（glycoside hydrolase, GH）谱，以展示该能力。

论文解读：DEFT融合序列与结构信息实现酶学分类并预测肠道细菌黏蛋白O-聚糖降解酶

酶是代谢中的主要催化单元，酶学委员会（EC）编号系统提供了根据催化功能对酶进行层级分类的标准框架。近年来，基于蛋白质语言模型（PLM）的方法如CLEAN和ProteInfer提升了基于序列的EC编号预测能力，但在最深层级（第四位数字）的精细分类上仍力不从心。基于结构的比对方法能有效识别整体结构相似的蛋白质，但常因功能分化仅取决于局部催化结构域而产生高假阳性率。由于酶功能依赖于相对较小的催化区域，纯结构比对难以可靠区分结构相似但功能不同的酶。针对这一问题，研究人员提出了深度酶功能转移（DEFT）方法，其核心思路是先用PLM预测EC编号前两级以大幅降低纯结构方法的假阳性，再用结构比对预测后两级，从而实现高精度的EC编号预测。通过基准数据集评估，DEFT在精确率和召回率上均优于现有最先进工具；同时其计算效率支持全基因组酶库注释，研究团队通过实验验证了DEFT预测的肠道黏液相关细菌糖苷水解酶（GH）谱，证明了该方法在代谢表型筛查中的实用价值。

研究人员发展了DEFT的三个主要技术环节：粗预测、比对和过滤。粗预测使用结构感知的蛋白质语言模型SaProt，将氨基酸序列与Foldseek生成的3Di结构表示融合，经LoRA微调分类78种EC前缀（前两位编号）。精细预测采用Foldseek优化的Smith-Waterman算法，在基于AlphaFold预测结构构建的参考数据库（源自CLEAN的50%序列同源性训练集）中搜索候选匹配。过滤步骤保留E值显著且粗预测前缀一致的比对，并转移模板酶的全四层EC编号。模型训练使用Adafactor优化器，学习率为10^-4，共10轮。基准评估采用Yu等建立的New-392和Price-149数据集，并沿用相同的训练/测试划分；实验验证选取七种厌氧肠道菌株，包括已知粘蛋白降解菌Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835（Am）和Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29148（Bt），非降解菌Lactobacillus plantarum ATCC 8014、Lactobacillus reuteri ATCC 23272、Bifidobacterium dentium ATCC 27678、Escherichia coli Nissle（EcN），以及条件性降解菌Bifidobacterium longum subsp. longum ATCC 15707（Bl）。通过厌氧培养和靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）测定培养上清中单糖浓度，以评估DEFT预测的功能表型。

研究结果分为三部分。第一部分为“DEFT provides superior enzyme classification performance”（DEFT提供优越的酶分类性能）。在New-392和Price-149数据集上，DEFT的精确率和召回率全面超越所有序列或结构方法。在Price-149上，DEFT的F₁分数为0.72，优于CLEAN的0.48和GraphEC的0.61；在New-392上，DEFT的F₁为0.84，GraphEC为0.59。分层交叉验证显示，对于训练集中出现次数少于5次的稀有EC编号，DEFT的召回率仍保持在较高水平，而CLEAN则显著下降，表明DEFT对稀有酶类的分类更具鲁棒性。

第二部分为“DEFT facilitates genome-wide profiling of enzyme repertoires”（DEFT促进酶库的全基因组谱分析）。研究人员将DEFT应用于七种肠道细菌的全基因组扫描，预测参与粘蛋白O-聚糖代谢的GH谱。结果显示，粘蛋白降解菌Am和Bt均被预测编码关键GH，包括α-岩藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）、α-N-乙酰半乳糖胺酶（3.2.1.49）、β-N-乙酰己糖胺酶（3.2.1.52）、α-N-乙酰葡萄糖胺酶（3.2.1.50）和神经氨酸酶（3.2.1.18），且E值较低；而非降解菌中这些酶功能要么未被检出，要么匹配E值高出多个数量级。此外，Am对EC 3.2.1.52的匹配强度显著强于Bt，提示其水解末端N-乙酰己糖胺的能力可能更强。

第三部分为“Experimental growth rates and sugar measurements validate DEFT predicted enzyme profiles”（实验生长速率与糖浓度测量验证DEFT预测的酶谱）。在补充不同粘蛋白底物（猪胃粘蛋白PGM、猪Muc2、GalNAc修饰丝蛋白SA、GlcNAc修饰丝蛋白SU）的培养基中厌氧培养上述菌株。结果显示，Am在PGM或Muc2补充下生长提高约4倍，Bt提高15%至24%，而Bl及非降解菌无显著生长促进。靶向LC-MS分析显示，Am在Muc2补充培养基中显著增加了GalNAc、GlcNAc、Neu5Ac、岩藻糖和半乳糖浓度；在SA/SU补充时分别选择性增加GalNAc和GlcNAc。Bt仅在与SA或SU培养时出现相应单糖增加。非降解菌未观察到此类糖浓度变化。研究发现PGM培养基本身含有游离岩藻糖和Neu5Ac，可解释细菌对这些糖的消耗。非粘蛋白糖（如甘露糖、葡萄糖）的变化模式与预测GH谱不完全一致，说明它们不是粘蛋白降解的特异性指标。

在讨论部分，研究人员指出DEFT的混合策略有效克服了纯结构比对易产生假阳性的缺陷，且计算速度快（单台NVIDIA H200上5分钟内可注释5000个蛋白）。对比测试显示，CLEAN和Foldseek会错误地为Escherichia coli预测GH活性，而DEFT正确排除了这些假阳性，证明其具备更高的特异性。讨论同时承认局限性：EC编号并不总能区分功能亚类，例如EC 3.2.1.52同时涵盖内切和外切β-N-乙酰己糖胺酶活性；一些新鉴定酶尚无EC编号；此外DEFT仅预测功能存在与否，未考虑酶活性、底物亲和力或表达水平差异。未来可引入用户自定义的第五位伪EC编号子类或结合动力学参数以精细化预测。

研究结论可概括为：DEFT是一种强大的计算方法，能够快速、准确地扫描全基因组并推断目标代谢表型，其通过预测多个催化活性（EC编号）为从基因组数据预测复杂生物体功能提供了有效途径，肠道细菌粘蛋白O-聚糖降解案例的实验验证进一步支持了该方法的可靠性。